【摘 要】
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目的:乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤之一,严重威胁女性健康。化疗耐药是乳腺癌治疗失败的主要原因,也是影响临床患者预后的重要因素。临床上大约有30-80%的肿瘤细胞在化疗过程中产生耐药导致化疗的失败,90%以上癌症患者的死亡是由多药耐药导致的。因此,如何克服化疗耐药是目前临床亟待解决的关键问题。外泌体是细胞分泌的直径为30-150nm的小囊泡,它广泛存在于人的体液中,并且可以携带蛋白质、RNA等多
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目的:乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤之一,严重威胁女性健康。化疗耐药是乳腺癌治疗失败的主要原因,也是影响临床患者预后的重要因素。临床上大约有30-80%的肿瘤细胞在化疗过程中产生耐药导致化疗的失败,90%以上癌症患者的死亡是由多药耐药导致的。因此,如何克服化疗耐药是目前临床亟待解决的关键问题。外泌体是细胞分泌的直径为30-150nm的小囊泡,它广泛存在于人的体液中,并且可以携带蛋白质、RNA等多种生物因子。有研究证明,外泌体可以在细胞之间传递耐药信息,导致敏感细胞的耐药性增强。MMP1是基质金属蛋白酶家族中的一员,它在阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR中的表达高于敏感细胞系MCF-7,且敲除MMP1基因可降低MCF-7/ADR细胞的耐药性。本实验通过将耐药细胞株分泌的外泌体与其敏感细胞株共培养,探讨MMP1可否通过外泌体这一途径传导耐药信息,为探寻肿瘤细胞化疗耐药的机制提供新的思路。方法:1.用RT-PCR检测MMP1在乳腺癌MCF-7细胞、MCF-7/ADR细胞以及MDA-MB-231细胞、MDA-MB-231/ADR细胞中的表达水平。2.超速离心法提取上述四种的外泌体,并对提取的外泌体进行鉴定。3.用流式细胞术、免疫电镜检测MMP1在MCF-7细胞外泌体、MCF-7/ADR细胞外泌体以及 MDA-MB-231 细胞外泌体、MDA-MB-231/ADR细胞外泌体上的表达水平。4.将MCF-7/ADR细胞外泌体和MDA-MB-231/ADR细胞外泌体用PKH67标记后,共聚焦显微镜观察MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞对其耐药株外泌体的摄取情况。5.用CCK-8检测MCF-7细胞与以及MDA-MB-231细胞与其耐药株外泌体共培养后对阿霉素IC50的变化。6.用 RT-PCR 和 Western Blot 技术检测 MCF-7 细胞以及 MDA-MB-231 细胞与ADR/EXO共培养后MMP1的表达水平。7.用免疫组化技术检测MMP1在新辅助化疗耐药患者和敏感患者病理组织中的表达水平。8.用流式细胞术检测新辅助化疗耐药患者和敏感患者的血浆外泌体中MMP1的表达水平。结果:1.耐药株MCF-7/ADR中MMP1基因的相对表达量是其敏感株MCF-7的19.60倍,耐药株MDA-MB-231/ADR中MMP1基因的相对表达量是其敏感株MDA-MB-231的14.40倍,差异具有统计学意义（P＜0.01）。2.透射电镜观察外泌体呈现出典型的杯口状或类似橄榄球的椭圆形,大小在40-150nm左右。Western Bloting检测外泌体的标记蛋白CD81在外泌体上高表达,而细胞内质网的特异性分子Calnexin在外泌体上低表达。3.免疫电镜显示耐药细胞株外泌体周围的金颗粒数量明显多于敏感细胞外泌体,说明MMP1在ADR/EXO中含量更高,差异具有统计学意义（P＜0.01）。4.流式细胞术检测MCF-7/ADR外泌体中MMP1的相对表达量是其敏感株MCF-7外泌体的2.15倍,MDA-MB-231/ADR外泌体中MMP1的相对表达量是其敏感株MDA-MB-23 1外泌体的1.21倍,差异具有统计学意义（P＜0.01）。5.激光共聚焦显微镜观察到耐药细胞分泌的外泌体可以被敏感细胞摄取,且摄取量随着共培养时间的延长有所增加。6.Western blot 检测 MCF-7+ADR/EXO 的 MMP1 相对表达量是 MCF-7 的2.4 倍,差异具有统计学意义（P＜0.05）,MDA-MB-231+ADR/EXO 的 MMP1相对表达量是MDA-MB-231的1.64倍,差异有统计学意义（P＜0.05）。RT-PCR检测MCF-7+ADR/EXO的MMP1 mRNA相对表达量是MCF-7的6.02倍,差异具有统计学意义（P＜0.01）,MDA-MB-23 1+ADR/EXO 的 MMP1 mRNA 相对表达量是MDA-MB-231的1.64倍,差异有统计学意义（P＜0.01）。7.CCK-8检测MCF-7与其耐药株外泌体共培养后,IC50升高了 2.97倍,差异有统计学意义（P＜0.05）,MDA-MB-231与其耐药株外泌体共培养后,IC50升高了 2.95倍,差异有统计学意义（P＜0.05）。8.免疫组化检测在新辅助化疗患者乳腺肿瘤组织,耐药组MMP1表达水平明显高于敏感组。流式细胞术检测耐药患者血浆外泌体中MMP1表达水平明显高于敏感患者。结论:1.MMP1在乳腺癌耐药细胞株高表达。2.耐药细胞外泌体中MMP1的表达高于敏感细胞外泌体。3.携带MMP1的外泌体可以被细胞摄取并传递耐药性。4.外泌体来源的MMP1可以作为检测乳腺癌化疗耐药的指标。
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