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20-羟二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE)是Oliw等学者近年发现的花生四烯酸经由细胞色素P-450酶(Cytochrome P-450,CYP)代谢途径生成的具有生物活性的类花生酸。研究发现,CYP的同工酶CYP4A和4F在大鼠及犬心脏中表达,在心肌缺血再灌注损伤进程中20-HETE含量增加,阻断其合成可减小灌注后心肌梗死面积。我们前期研究发现,20-HETE具有诱导培养的乳鼠心肌细胞凋亡作用,并通过线粒体依赖机制参与血管紧张素II诱导的细胞凋亡。此外,还有研究发现,20-HETE参与异丙肾上腺素、苯并芘以及血管紧张素II诱导的非适应性心肌肥大进程中。虽然研究表明20-HETE在诱导心肌细胞凋亡以及肥大进程中发挥重要作用,但具体分子机制尚待进一步阐明。心肌细胞内Ca2+超载是造成细胞凋亡和肥大的关键因素,本实验室前期研究发现,20-HETE可激活心肌细胞L型Ca2+通道造成细胞Ca2+超载,而作为心肌细胞中调节Ca2+稳态平衡非常重要的激酶——钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Camodulin modulated kinase II,CaMK II),在心肌细胞凋亡及肥大等缺血性心肌病的病理过程中发挥关键作用。值得关注的是,有研究发现在血管平滑肌细胞中,CaMK II可耦联G蛋白受体从而导致细胞膜花生四烯酸的释放,进而经由CYP4A/F酶催化生成20-HETE,提示CaMK II的激活可能是20-HETE依赖的血管反应性增强的机制。然而,CaMK II信号通路其是否参与了20-HETE诱导的心肌细胞[Ca2+]i浓度改变并介导了心肌细胞凋亡和肥大,目前尚无报道。因此,本研究目的主要是在培养的乳鼠心肌细胞中,通过观察20-HETE对细胞内Ca2+浓度影响来研究其诱导心肌细胞凋亡和肥大的机制,并探究其中CaMK II信号通路的作用。目的:1.观察20-HETE对培养的乳鼠心肌细胞凋亡及肥大作用;2.研究CaMK II对20-HETE诱导的心肌细胞Ca2+浓度改变及凋亡、肥大的影响。方法:1.培养并纯化新生SD乳鼠(<3d)心肌细胞,接种至培养瓶中(接种密度5×105/孔),培养箱中培养48h。实验分组:除CCK-8实验外,其他实验随机分为4组:对照组,细胞不做任何药物处理继续培养24 h;20-HETE组,20-HETE(100 nmol/L)处理细胞后继续培养24 h;20-HETE+KN-93组,KN-93(3μmol/L)预处理30min后加入20-HETE(100 nmol/L)培养24 h;KN-93组(3μmol/L),单独KN-93处理细胞后培养24 h。2.细胞无血清培养12 h后,分别加入1nmol/L、3nmol/L、10nmol/L、50nmol/L以及100nmol/L浓度梯度的20-HETE培养24h,CCK-8法检测心肌细胞活性;3.TUNEL法检测心肌细胞凋亡率,HE染色后检测心肌细胞表面积,BCA法检测心肌细胞总蛋白含量,RT-qPCR法检测心肌肥大标志性基因ANP表达;4.Flou-3/AM荧光染色激光共聚焦显微镜检测心肌细胞[Ca2+]i浓度;5.Western-Blot法检测RyR2、SERCA2a、CaMK II及磷酸化CaMK II(p-CaMK II)蛋白表达。结果:1.20-HETE可呈浓度依赖和时间依赖性降低心肌细胞活性,100 nmol/L的20-HETE处理24h后,心肌细胞活性显著下降至58.3±4.22%(P<0.05);2.TUNEL法染色结果显示,20-HETE处理后染色阳性细胞数由对照组的2.0±1.05%显著增加至49.8±2.3%(P<0.05),加入CaMK II阻断剂KN-93可降低20-HETE诱导的TUNEL染色阳性细胞数增加(23.1±4.12%,P<0.05),单独KN-93处理组无明显变化(P>0.05);3.与对照组相比,20-HETE组心肌细胞表面积由(501.2±20.5)μm2显著增加至(956.7±85.5)μm2(P<0.05),细胞总蛋白含量由(1.61±0.03)mg/mL增加至(2.46±0.05)mg/mL(P<0.05),心肌肥大标志性基因ANP表达显著升高53.9%(P<0.05),加入KN-93共孵育后可阻断20-HETE如上作用,单独加入KN-93作用无显著差异(P>0.05);4.Flou-3/AM荧光染色结果显示,与对照组相比,20-HETE组心肌细胞荧光强度显著增加75%(P<0.05),而与KN-93共孵育组可显著抑制20-HETE诱导的细胞内Ca2+浓度升高(P<0.05),单独加入KN-93组对细胞内Ca2+浓度无明显影响(P>0.05);5.与对照组相比,20-HETE处理组心肌细胞RyR2蛋白表达比对照组升高3.8倍(P<0.05),SERCA2a表达下降21%(P<0.05),与KN-93共孵育后可抑制20-HETE的此作用,单独KN-93处理组蛋白表达变化不明显(P>0.05)。6.与对照组相比,20-HETE处理后,显著升高了心肌细胞CaMK II以及磷酸化CaMK II的蛋白表达。结论:1.20-HETE诱导培养的乳鼠心肌细胞凋亡及肥大;2.CaMK II介导20-HETE诱导的心肌细胞凋亡及肥大。