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【背景、目的】导致心血管系统疾病的因素有很多,其中动脉粥样硬化病变是其中之一,它不但是脂质紊乱的一种状态,而且是慢性炎症性疾病的一种,其最主要的特征是胆固醇在动脉内膜大量堆积。动脉粥样硬化发生发展的一个重要节点是:血管内皮受损。1-磷酸鞘氨醇(S1P)处理人脐静脉内皮细胞(HUVEC)可明显抑制细胞凋亡,促进细胞存活,其机制与PI3K-AKT信号途径有关。SR-BI与apoA-1相结合,从而介导HDL的各种功能。HDL结合S1P(HDL-S1P)的血管保护作用重要机制之一是:S1P与血管内皮细胞上面的膜受体(主要是S1PR1-S1PR5)相互之间产生反应,因而生成了各种不一样的生物学效应。多次研究证实,在内皮细胞中S1PR1受体的作用主要是对抗动脉粥样硬化(AS),且主要是S1P/S1PR1通过PI3K-Akt信号通路来介导的。因此,本论文主要研究ApoA-1/SR-BI通过PI3K/Akt途径协同S1P/S1PR1调节ox-LDL诱导的人脐静脉内皮细胞的炎症应答。【实验方法】(1)培养HUVEC,用不同浓度和不同时间的S1P处理细胞,采用人ELISA试剂盒检测细胞培养液中IL-6、IL-8和IL-10的分泌水平。(2)培养HUVEC,ox-LDL处理细胞6小时后,分别加入S1P,S1P+W146(S1PR1阻断剂),S1P+JTE-013(S1P2阻断剂),S1P+CAY10444(S1P3阻断剂)处理细胞24h,人ELISA试剂盒检测细胞培养液中IL-6、IL-8和IL-10的分泌水平,采用Western Blot检测MCP-1、ICAM-1蛋白表达的量。(3)培养HUVEC,分别用S1P(1.0μM),apoA-1(30μg/ml),S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml),S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)+pcDNA3.1(-)-hSR-BI,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)+BLT-1(10μM)(SR-BI阻断剂)处理细胞24 h后,再用ox-LDL处理细胞6小时,采用人ELISA试剂盒检测细胞培养液中IL-6、IL-8和IL-10的分泌水平。(4)培养HUVEC,ox-LDL处理细胞6小时后,分别用S1P,S1P+apoA-1,S1P+apoA-1+LY294002(PI3K阻断剂)处理细胞24 h,采用人ELISA试剂盒检测细胞培养液中IL-6、IL-8和IL-10的分泌水平;Western Blot检测PI3K磷酸化水平。(5)培养HUVEC,ox-LDL处理细胞6小时后,分别用S1P,S1P+apoA-1,S1P+apoA-1+MK2206(AKT阻断剂)处理细胞24 h,采用人ELISA试剂盒检测细胞培养液中IL-6、IL-8和IL-10的分泌水平;Western Blot检测AKT磷酸化水平。(6)培养HUVEC,ox-LDL处理细胞6小时后,分别用S1P,apoA-1,S1P+apo A-1,S1P+apoA-1+LY294002(PI3K阻断剂),S1P+apoA-1+MK2206(AKT阻断剂)处理细胞24 h,采用免疫荧光检测NF-κB的核转位。结果:(1)1μΜS1P刺激HUVEC 24h后,IL-6和IL-8在培养液中的分泌量降到了最低,IL-10的分泌量升到了最高。(2)与对照组相比,S1P组的IL-6、IL-8的分泌量降低,MCP-1和ICAM-1的蛋白表达量亦降低;而S1P(1.0μM)+JTE-013(S1P2阻断剂)组达到最低,IL-10的分泌量增加。(3)与对照组相比,S1P(1.0μM)组、apoA-1(30μg/ml)组IL-6、IL-8的蛋白分泌水平降低,IL-10的蛋白分泌水平增加;与S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)组相比,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)+pcDNA3.1(-)-hSR-BI组IL-6、IL-8的蛋白分泌水平明显降低,IL-10的蛋白分泌水平明显增加;与S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)组相比,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)+BLT-1(SR-BI阻断剂)组IL-6、IL-8分泌的量增多,IL-10的蛋白分泌的量减少。(4)与对照组相比,S1P(1.0μM)组,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)组,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)+LY294002(PI3K阻断剂,10μM)组IL-6、IL-8在培养液中的水平降低,IL-10的分泌水平增加;与S1P(1.0μM)组相比,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)组和S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)+LY294002(PI3K阻断剂,10μM)组IL-6、IL-8的分泌水平均降低,IL-10的分泌水平均增加。与S1P组相比,S1P+apoA-1+LY294002组的PI3K磷酸化(p-PI3K)蛋白表达降低。(5)与对照组相比,S1P(1.0μM)组,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)组,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)+MK2206(AKT阻断剂,10μM)组IL-6、IL-8在培养液中的水平降低,IL-10的分泌水平增加;与S1P(1.0μM)组相比,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)组和S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)+MK2206(AKT阻断剂,10μM)组IL-6、IL-8的分泌水平均降低,IL-10的分泌水平均增加。与S1P组相比,S1P+apoA-1+LY294002组的Akt磷酸化(p-Akt)蛋白表达降低。(6)与S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)组相比较,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)+LY294002(10μM)(PI3K抑制剂)组,S1P(1.0μM)+apoA-1(30μg/ml)+MK2206(1.0μM)(Akt抑制剂)组免疫荧光检测NF-κB的核转位水平显著降低。结论:(1)S1P/S1PR1可介导血管内皮细胞的抗炎效应。(2)S1P/S1PR1介导的血管内皮抗炎效应受SR-BI调节。(3)S1P/S1PR1对血管内皮的抗炎反应与SR-BI/PI3K/AKT通路相关。