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目的:MicroRNAs是重要的基因调控因子,被认为在肿瘤发生过程中起着关键的作用。研究已证明,miRNA-30a是一种能够发挥抑癌作用的microRNA分子。研究者已经在多种恶性肿瘤中发现miRNA-30a的表达出现异常下降,包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌以及黑色素瘤等多种肿瘤;同时证实miRNA-30a的表达降低往往与恶性肿瘤患者预后密切相关,具有作为预测肿瘤患者预后的潜在价值。因此,本文以miRNA-30a为研究对象,探索在临床结肠癌组织样本和对应癌旁正常组织中miRNA-30a的表达水平改变,从而确认miRNA-30a的表达与结肠癌患者临床病理指标的关联性;探索miRNA-30a对结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭转移能力以及化疗敏感性的调控作用;探索miRNA-30a在调控结肠癌细胞恶性生物学行为的靶点蛋白。我们希望通过本研究,探讨miRNA-30a在结直肠癌转移侵袭过程中的调控作用,并以此为基础寻找抑制肿瘤转移的新型靶点,为肿瘤治疗提供新的路径。方法:1)采用Realtime PCR检测50例临床结肠癌组织和对应癌旁组织中miRNA-30a的表达改变,并分析miRNA-30a表达水平与结肠癌患者临床病理特征的关联性以及其与结肠癌患者5年生存率之间的关系;2)构建miRNA-30a过表达的慢病毒载体,转染人结肠癌HCT-116细胞增强其miRNA-30a的表达水平。采用MTT、流式细胞术和Transwell侵袭迁移实验实验检测miRNA-30a对结肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭能力以及化疗敏感性的影响;3)采用生物信息学软件对miRNA-30a调控的下游靶基因进行预测和筛选,然后使用双荧光素酶报告基因实验、Realtime PCR和western blot进行实验验证,从而对miRNA-30a的调控靶点进行深入的探索。结果:1)在临床研究中,miRNA-30a在癌旁组织和结肠癌组织中的表达水平分别为:5.38±1.20和1.05±0.12,miRNA-30a在癌旁正常组织的表达水平显著高于结肠癌组织,差异有统计学意义(P<0.05);2)以miRNA-30a表达水平的中位数为界,将50例结肠癌患者分为两组:miRNA-30a高表达组和miRNA-30a低表达组。我们对miRNA-30a的表达水平与结肠癌患者临床病理特征之间的关系进行关联性分析,c2检验显示,民族、性别、年龄、肿瘤部位及大小、肿瘤的分化程度与miRNA-30a的表达水平无关联性;而与肿瘤的浸润深度(T分期)、淋巴结转移(N分期)、TNM分期和与miRNA-30a的表达水平显著相关(P<0.05)。进一步分析miRNA-30a表达水平与结肠癌患者年生存率之间的关系,发现miRNA-30a的高表达组(24例)的5年无转移生存率对比miRNA-30a的低表达组(26例)明显增高(P<0.05);3)miRNA-30a过表达慢病毒载体构建成功后,通过鉴定表明miRNA-30a的过表达重组慢病毒载体构建成功。筛选结果显示,转染miRNA-30a的慢病毒载体(LV-hsa-mir-30a)或空白载体NC(LV-hsa-mir-NC)感染结肠癌HCT-116细胞后,可见约80%以上的结肠癌细胞出现绿色荧光,证实miRNA-30a慢病毒载体感染成功;4)采用Realtime PCR检测了感染LV-hsa-mir-30a或LV-hsa-mir-NC的结肠癌HCT-116细胞中miRNA-30a的表达,HCT-116细胞在感染LV-hsa-mir-30a的慢病毒后,miRNA-30a的表达水平出现显著增加,统计结果证实,mi R-30a的表达丰度是阴性对照组细胞的1408倍,差异具有统计学意义(P<0.001);5)随后我们在上述miRNA-30a过表达结肠癌细胞的基础上,对miRNA-30a调控结肠癌细胞增殖能力及其对癌细胞化疗敏感性的作用进行探索。MTT的细胞增殖抑制实验结果显示,miRNA-30a过表达组的结肠癌HCT-116细胞增殖能力受到显著抑制,细胞增殖抑制率显著高于对照组细胞(P<0.05);而在加入奥沙利铂注射液后,各组结肠癌细胞的增殖能力均受到显著抑制,其中miRNA-30a表达增强后,结肠癌细胞对奥沙利铂注射液的敏感性显著增强(P<0.05,与对照细胞+奥沙利铂注射液相比)。我们采用Transwell实验研究了miRNA-30a表达增强对结肠癌细胞迁移能力的影响。Transwell的下室中血清浓度高,能诱导结肠癌细胞向下室进行迁移。通过染色得到细胞迁移的检测结果。统计分析显示,miRNA-30a表达增强的结肠癌HCT-116细胞中,在血清的诱导下迁移通过聚碳酸酯膜的细胞数量显著低于空白对照组细胞(P<0.05)。此外,加入奥沙利铂注射液后,与空白对照组细胞相比,miRNA-30a的HCT-116细胞的迁移率显著下降43.2%(P<0.05)。在miRNA-30a过表达的HCT116细胞模型的基础上,我们检测了miRNA-30a表达增强对HCT116细胞凋亡水平以及化疗敏感性的影响,流式细胞术的检测结果显示,对照组HCT116细胞的凋亡比例为1.80±0.17%,阴性对照组的细胞凋亡比例为3.63±0.14%,miRNA-30a过表达的HCT116细胞凋亡比例为3.86±0.09%,均无统计学差异。但在加入奥沙利铂注射液后,miRNA-30a过表达的HCT116细胞凋亡比例显著增加至18.24±0.56%,显著高于对照组细胞(3.84±0.03%,P<0.01);6)生物信息学预测结合靶基因功能分析,筛选得到Beclin1作为miRNA-30a调控的下游靶基因。双荧光素酶报告基因系统检测进一步证实了该靶序列,Realtime PCR及Western blot结果证实mi R-30a能够抑制结肠癌HCT-116细胞Beclin1蛋白的表达。结论:1)miRNA-30a在结肠癌组织中的表达出现显著降低,并且miRNA-30a的异常表达与结肠癌的浸润程度以及淋巴结转移密切相关,并且与患者的预后有着密切的相关。提示miRNA-30a可能发挥调控结肠癌的发生、发展过程中具有重要作用;2)miRNA-30a表达上调能显著抑制结肠癌细胞的增殖、侵袭转移能力,并促进结肠癌细胞的凋亡和增强化疗的敏感性;3)Beclin1是miRNA-30a调控的下游靶基因,miRNA-30a-Beclin1有可能成为结肠癌治疗的作用靶点。