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MicroRNAs(miRNAs)在许多植物和动物的发育、代谢和疾病过程中发挥着重要作用。它们被视生理和病理进程中非常有用的生物标记物。胞外囊泡(EV)在生物体各种生命活动中同样发挥着重要的调节作用,胞外囊泡内的mi RNAs表达了更直接、更具体地关于细胞状态的信息,特别是在肿瘤的发生和发展过程中。因此对胞外囊泡内mi RNAs的作用研究,将对疾病的诊断和预后提供重要得多临床参考价值。CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated nucleases)系统以其高效、快速的特点被用于核酸的精确检测。在典型的CRISPR/Cas9系统中,Cas9蛋白在sgRNA(Single-stranded guiding RNA)存在的情况下,通过识别含有PAM(Protospacer adjacent motif)结构的dsDNA(Double-stranded DNA)而进行剪切。RCA(Rolling circular amplification)作为一种高度特异的恒温基因扩增方法,在热稳定DNA聚合酶的辅助下无需热循环仪器,在恒温(30℃甚至室温)下即可进行基因扩增。RCA反应的高特异性主要归因于引物和环状DNA模板之间需完全互补才得以启动扩增步骤,这使得它特别适用于单核苷酸多态性的分析。本研究综合了RCA和CRISPR/Cas9两种技术的优点,构建了一个多功能的等温多靶标核酸检测平台—RACE,可用于胞外囊泡内多种miRNAs的等温定量检测,这对于疾病诊断和预后评估具有重要意义。本研究中设计了一种特异性的锁式探针识别靶标miRNA,在HiFi Taq DNA连接酶和Phi29 DNA聚合酶的作用下进行RCA,扩增后的长ssDNA(Single-stranded DNA)上大量重复的靶标序列与TaqMan探针结合会形成大量PAM结构,可被sgRNA特异性识别,并利用Cas9蛋白强大的外切酶活性剪切靶标序列与TaqMan探针从而使荧光“开启”,可以方便地用光谱学方法测量。对于多重检测,可以引入与特异性靶标miRNA互补的多色TaqMan探针来启动多色检测。RCA是一种常用的miRNA等温扩增技术,可以对靶标序列实现信号放大,同时也可以作为对靶标mi RNA的第一重识别。本研究将CRISPR/Cas系统与RCA结合的巧妙之处在于,扩增子ssDNA上大量重复的靶标序列与TaqMan探针杂交形成PAM结构,sgRNA通过PAM结构实现对靶标序列的特异性识别,这是对靶标miRNA的第二重识别。双重识别后,Cas9蛋白对靶标序列和TaqMan探针杂交的双链剪切,荧光恢复。RCA的作用是扩增实现信号放大,CRISPR/Cas9的作用是识别和剪切。综上所述,RCA与CRISPR/Cas9两种技术的结合,实现了对靶标mi RNA的信号放大和双重识别,提高了miRNA检测的灵敏度和特异性,并且避免了使用传统荧光探针的假阳性结果。研究结果表明RACE具有单碱基识别和多靶标同时检测性能,RACE不仅对A549细胞来源的胞外囊泡内miRNAs成功实现了多靶标检测,也对临床非小细胞肺癌(Nonsmall cell lung cancer,NSCLC)患者血浆来源的胞外囊泡内多个miRNAs成功检测,证明了RACE适用于所有来源的miRNA检测。RACE和RT-qPCR的方法比较结果显示,两种方法检测体外培养的A549细胞来源和临床肺癌患者血浆来源的胞外囊泡内miRNAs丰度时,表现出高度地一致性,验证RACE这种方法的可行性和稳定性,揭示了RACE在各种疾病的筛查、诊断和预后中的潜力。总之,RACE是一个强大的核酸检测工具,具有单碱基识别特性,并且检测灵敏度下限可达到90fM,能够在常温下实现对多靶标miRNA的同时检测。它具有稳定、快速、便携的性能,可用于现场实时诊断中对核酸进行多靶标、特异性检测。