研究背景截至2015年全球约有4.15亿糖尿病(Diabetic Mellitus,DM)患者,预计到2040年该数量将增长至6.42亿。随着糖尿病患者数量的迅速增长,其慢性并发症的预防与诊疗也成为目前亟待解决的问题。糖尿病足(Diabetic Foot,DF)是糖尿病常见的慢性并发症之一,15%～27%的糖尿病患者因足部溃疡而截肢。感染是导致糖尿病足溃疡愈合不良的直接原因之一,合并感染的DF患者的截肢率是不合并感染者的154.5倍,截肢后患者5年内病死率高达50%。可见,及时、有效地控制感染是减少糖尿病足感染(Diabetic foot infection,DFI)患者截肢致残致死的重要途径。提高经验性抗感染治疗的有效性,明确创面感染病原菌取材方式的可靠性,改善病原菌鉴定方式的时效性及准确性对DFI患者的诊疗均有至关重要的意义,是当今世界的一项重要课题。目前微生物培养及药物敏感性分析耗时长(平均3-5天),无法在第一时间指导临床抗生素选择。有研究表明56%的DFI患者由于初始经验性抗感染治疗方案不敏感而最终更改了方案,耽误了有效治疗时间。了解DFI病原菌分布及耐药性特点,根据伤口特征有针对性地选择抗生素治疗方案,可显著提高经验性抗感染治疗的有效性。此前有研究证明不同Wagner级别的DFI病原菌分布存在差异。在环境、呼吸道感染等领域有研究提示气候、地域对病原菌分布有一定影响。此外,随着不合理使用抗生素的现象日益增加,病原菌对抗生素的耐药性变化越来越迅速。过去的研究缺乏对不同性质DFI溃疡的病原菌分布特征分析,且忽略了季候对DFI病原菌生长的影响,对于耐药性变迁的研究亦较少。了解不同伤口特征、不同季候的DFI创面病原菌分布情况及耐药性变迁,将为临床合理选择抗菌药物提供依据,从而提高经验性抗感染治疗的有效性。美国传染病学会(Infectious Diseases Society of America,IDSA)及国际糖尿病足工作小组(International Working Group on Diabetic Foot,IWGDF)建议所有临床诊断为DFI的患者均应从创面取得感染标本进行微生物培养及药敏分析,以进一步指导、调整初始抗生素治疗方案。IWGDF指出DFI病原菌鉴定应以组织培养结果作为金标准。然而,组织取材容易损伤周围组织,而拭子采样操作简便且相对无创,在临床上应用得更为广泛。目前对于创面棉拭子标本培养在DFI病原菌诊断中的可靠性存在争议。大部分研究者认为创面拭子擦拭的取材方式容易被表面定植菌污染,且较难获取深部组织中的感染菌群,无法真实反应创面感染病原菌。与之相反,有研究显示创面拭子与深部组织的微生物学检测结果并无显著差异,因此提出了没有必要进行深部组织取材的结论。过去的研究忽略了不同溃疡深度对拭子及组织培养结果一致性的影响。在不同感染程度的DFI创面中重新评估拭子与深部组织微生物学检测结果的一致性,对于建立正确的DFI创面取材方式,提高临床病原菌诊断的可靠性有重大意义。目前临床感染标本的病原菌诊断通常采用微生物培养,但其存在一定局限性:1、耗时长,无法在第一时间指导临床抗生素选择;2、由于大多数细菌生长环境需求苛刻,传统细菌培养只能识别2%已知的细菌;3、由于通过培养鉴定的病原菌是在典型的营养环境下分离得出,而临床感染标本中的病原菌往往是在不典型的环境下生长,因此传统细菌培养不一定能够揭示体内真实的菌群结构。16S rRNA基因高通量测序技术是一种基于分子标记的能够高效获取样品中微生物指纹和特征性核苷酸序列的方法。与传统培养技术相比,其最大的优势在于速度快、不受细菌生长环境限制。Ion Torrent Personal Genome Machine(PGM)是目前运行速度最快的测序平台之一(运行时间2.3-7.3小时),此前已有研究者利用该平台验证了 16SrRNA基因测序在肺囊性纤维化患者的痰液标本中进行病原菌鉴定的可行性、时效性以及准确性。进一步证实基于PGM平台的16S rRNA基因高通量测序技术在DFI病原菌鉴定中的可行性,将为利用该技术实现DFI病原菌的快速鉴定提供依据。此外,有研究者提出皮肤表面存在某些保护宿主不受病原菌侵袭的共生菌群。比较皮肤表面与DFI创面中菌群结构的差异性,分析创面中占主导作用的致病菌,推测皮肤微生态中可能的益生菌,将为DFI患者的预防与治疗带来新的视角与靶点。第一章糖尿病足创面感染病原菌分布及耐药性15年变迁目的探讨DF创面感染病原菌分布特点及耐药性变迁,指导临床抗生素选择,提高经验性抗感染治疗的有效性。对象及方法1.研究对象收集2000年1月至2014年12月在南方医科大学南方医院住院治疗的580例DFI患者的病例资料,回顾性分析其一般临床资料、创面棉拭子微生物培养及药敏结果。580例患者均符合WHO制定的糖尿病诊断标准及IDSA制定的DFI诊断标准。2.研究方法(1)分组:580例DFI患者按照溃疡PEDIS感染级别分为PEDIS2级组(96例),PEDIS3级组(314例),PEDIS4级组(170例);根据有无合并下肢动脉缺血和周围神经病变,判断溃疡性质为神经性(339例)、缺血性(48例)、混合性溃疡(193例);季节采用候温法划分,根据广东省月平均气温将季节划分为春季(2～3月)、夏季(4～10月)、秋季(11～1月)3个季节。比较上述各组病原菌分布特点。并根据耐药性变化趋势将资料按年份分为2组:2000～2010年、2011～2014年,分析15年来DFI病原菌对不同抗生素的耐药性变迁情况。(2)统计分析:采用SPSS 19.0版软件进行统计分析。计量资料用Kolmogorov-Smimov test检验是否为正态分布,符合正态分布的计量资料用平均数±标准差表示,不符合正态分布的数据以中位数(第一四分位数,第三四分位数)表示。计数资料用率或构成比表示,多组间比较采用卡方检验。利用Logistic回归分析DFI病原菌分布的影响因素。取P<0.05为差异有统计学意义。结果1.Logistic回归分析结果提示DF溃疡PEDIS感染级别(P<0.001)及季节(P<0.01)共同影响DFI病原菌类型。溃疡性质对DFI病原菌分布的影响无统计学意义(P>0.05)。2.PEDIS2级的DFI溃疡在各季节均以G+菌感染为主;PEDIS4级的DFI溃疡在各季节均以G-菌感染占优势;而PEDIS3级者在春秋季以G+菌感染为主(55.3%),夏季以G-菌感染为主(53.3%)(P<0.05)。各个季节DFI创面的混合感染率均随着PEDIS级别的增加而上升(P<0.01)。3.G+菌以葡萄球菌属为主(44.7%),对青霉素、氨苄西林完全耐药,对万古霉素、利奈唑胺100%敏感,15年来对阿莫西林/克拉维酸钾的耐药率由15.0%上升至48.1%(P<0.05):G-菌以肠杆菌科最常见(61.3%),对氨苄西林耐药率最高(91.3%),对美罗培南最敏感(99.5%),15年来对头孢噻肟的耐药率由29.2%增长至 43.7%(P<0.05)。结论1.对DFI患者经验性抗感染治疗时可综合考虑溃疡PEDIS级别与季节因素对感染病原菌类型的影响,并结合不同类型病原菌对抗生素的敏感性特点有针对性地选择抗生素。2.15年来我院DFI病原菌随着时间变迁对多种抗生素的耐药性较早年有升高趋势,其中β-内酰胺类、头孢菌素类尤甚。根据伤口特征合理有针对性地使用抗菌药物,减少抗生素的滥用,对防止、延缓病原菌的耐药性增长,提高抗感染治疗的有效性有重大意义。第二章糖尿病足感染创面拭子及深部组织微生物培养结果的一致性研究目的在不同感染程度DFI创面中比较棉拭子及深部组织标本微生物培养结果的一致性,评价创面棉拭子培养对DFI病原学诊断的有效性。对象及方法1.研究对象本研究连续纳入了 2014年10月至2015年7月在南方医科大学南方医院住院治疗的56例DFI患者。56例患者均符合WHO制定的DM诊断标准及IDSA制定的DFI诊断标准。本研究经南方医院伦理委员会批准并取得了所有纳入患者的知情同意书。2.研究方法(1)分组:按照创面PEDIS感染级别分为3组:2级(10例)、3级(29例)、4级(17例)。(2)DFI创面棉拭子擦拭取样:采用Levine棉拭子擦拭法。(3)DFI创面深部组织取样:采用组织钻取法。(4)微生物培养:参照《全国临床检验操作规程》进行。(5)统计学分析:3组间计量资料的比较采用单向方差分析(正态分布数据)及Kruskal-Wallis H检验(非正态分布数据)。3组间变化趋势检验采用线性回归(正态分布计量资料)、Spearman相关检验(非正态分布计量资料)及趋势卡方检验(计数资料)。余同第一章。结果1.DFI创面棉拭子标本及深部组织标本均培养出81株病原菌(平均每个标本1.4株)。在不同PEDIS级别组中,2种不同取样方法对于单一感染或混合感染的诊断均无显著差异(P>0.05)。2.在PEDIS2级的DFI创面中,80.0%的棉拭子标本培养结果与对应深部组织培养出的病原菌完全一致,而在PEDIS3级和4级的DFI创面,该比例显著下降至 31.0%及 29.4%(P<0.05)。3.以深部组织培养结果作为金标准,评价棉拭子培养对DFI微生物学诊断的价值得出,棉拭子培养对于所有G+菌种类鉴定的敏感性均大于60%,特异性均大于80%。而在G-菌种类鉴定中,棉拭子微生物培养对于某些常见感染病原菌(如大肠埃希氏菌、摩根氏菌、枸橼酸杆菌)鉴定的敏感性很低(33.3%),另外有一些在深部组织标本中培养阳性的G-菌(沙雷氏菌、不动杆菌、皮氏拉斯通氏菌、抗坏血酸克鲁依弗氏菌)均未在对应的棉拭子标本中分离出来。结论1.创面棉拭子标本微生物培养鉴定对于指导PEDIS2级DFI患者的抗感染治疗方案,具有较高的可靠性。2.对于PEDIS感染级别≥3级的DFI患者而言,创面棉拭子标本对病原菌鉴定的可靠性显著下降,尤其是易遗漏深部组织感染G-菌的诊断。因此,进行创面深部组织培养对于该类患者的DFI病原学诊断有必要性。第三章基于高通置测序技术的糖尿病足感染病原菌快速鉴定及皮肤菌群多样性研究目的验证基于PGM平台的16S rRNA基因高通量测序技术在DFI病原菌快速鉴定中的可行性。并利用该技术比较DFI创面棉拭子标本及深部组织标本的微生物学检测结果。同时,分析皮肤表面与DFI创面菌群结构的差异性,探讨创面中占主导作用的致病菌,推测皮肤微生态中可能的益生菌。对象及方法1.研究对象纳入2015年1月至2015年7月在南方医科大学南方医院住院治疗的10例DFI患者。10例患者均符合WHO制定的DM诊断标准及IDSA制定的DFI诊断标准。本研究经南方医院伦理委员会批准并取得了所有纳入患者的知情同意书。2.研究方法(1)标本取材方法:DFI创面拭子擦拭取样采用Levine棉拭子擦拭法(S组,编号为S1、S2...S9、S10);DFI创面深部组织取样采用组织钻取法(T组,编号为T1、T2...T9、TIO);皮肤表面微生物取样采用无菌棉拭子擦拭法(C组,编号为 C1、C2...C9、C10)。(2)传统细菌培养:参照《全国临床检验操作规程》进行。(3)基因组DNA的提取与检测:采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒对所有标本进行基因组DNA提取。(4)16SrRNAV1-V2区基因片段的扩增及测序:以样本DNA为模板,采用通用引物27F和338R扩增其中的16SrRNAV1-V2区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收。对胶回收产物进行定量、均一化混匀后,于Ion Torrent PGM平台进行高通量测序,均采用Ion318芯片。(5)生物信息学分析:有效序列通过unique.seqscommand去杂、优化后,通过Mothur软件在97%的相似水平下对所有序列进行操作分类单元(Operational taxonomy unit,OTU)聚类,并将每一条优质序列与Silva数据库进行对比,找出最相近且可信度达80%以上的种属信息。3组之间alpha多样性指数的比较采用ANOVA分析,并通过Tukey’s HSD分析进行两两比较。利用R语言vegan包,vegdist及hclust进行距离计算和聚类分析,并绘制30个样本的菌群Heatmap图。采用R语言进行OTU分布统计及Venn图绘制,并利用R语言进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA),PC-ORD 进行绘图。采用 LEfSe 在线工具进行C组与T组间群落差异性分析。结果1.通过16SrRNA基因高通量测序检测到的菌属种类(平均每个样本66.1种)显著多于传统细菌培养检测到的菌属种类(平均每个样本1.5种)(P<0.001),且测序结果分析得出的菌群中均包含了传统细菌培养鉴定得出的病原菌。然而,80%传统细菌培养结果与测序诊断的优势菌群(丰度最高)不一致。2.基于测序结果进行Alpha多样性分析,结果显示:C组OTU数量、菌属数量及香农指数均显著高于T组及S组(P<0.001),而S组与T组之间的OTU数量、菌属数量及香农指数均无统计学差异(P>0.05)。3.基于测序结果进行Beta多样性分析,Venn图提示,C组与T组之间、C组与S组之间、S组与T组之间重叠的菌种序列数分别仅占11.4%、11.0%、31.0%。主成分分析显示代表C组样本的点与代表S组、T组的点能显著分开。部分代表S组样本的点与对应T组样本的距离很近(如S1和T1),而另一部分却明显的分离开(如S3和T3)。4.基于测序结果进行菌群结构分析,结果显示:糖尿病患者足部皮肤菌群结构中以葡萄球菌属占优势(44.4%),其次为棒状杆菌属(18.2%);在DFI创面中,70%棉拭子标本及50%深部组织标本以厌氧菌感染为主(包括Fusobacterium,Prevotella Bacteroides,Porphyromonas),而传统培养方法均未分离出厌氧菌株。5.通过LEfSe分析比较皮肤与创面的菌群结构,结果显示皮肤表面的Staphylococcus,Actinobacteria及 Propionibacteriaceae 等菌群与糖尿病患者的足部皮肤微生态相关性显著,而DFI创面中的Bacteroidales及Lactobacillates等菌群丰度显著高于皮肤。结论1.基于PGM测序平台的16S rRNA基因高通量测序技术可能作为临床DFI病原菌快速鉴定的有效手段。2.进行创面深部组织培养对于PEDIS3-4级的DFI患者的病原学诊断有必要性。3.皮肤表面的微生物多样性显著高于DFI创面,皮肤表面的Staphylococcus,Actinobacteria及Propionibacteriaceae等菌群与糖尿病患者皮肤微生态的相关性明显,而厌氧菌Bacteroidales及Lactobacillales在DFI创面菌群结构中有显著性影响。