研究背景：α-gal表位是广泛存在于非灵长类哺乳动物细胞表面的碳水化合物结构,由GGTA1基因编码的α1,3GT酶催化形成,能够与anti-Gal抗体特异性结合。由于物种进化,人类细胞不表达α-gal表位,但血清中存在天然anti-Gal抗体。α-gal/anti-Gal在物种间的表达差异为抗肿瘤治疗开拓了思路,其介导的抗肿瘤免疫治疗疗效已在黑色素瘤、胰腺癌等动物模型中得到验证,也为结直肠癌免疫治疗提供了新策略。然而,已被应用于临床试验的α-gal糖脂的治疗效果良莠不齐,原因在于该疗法主要依赖患者体内潜在的免疫系统功能,但肿瘤患者体内DC细胞和T细胞功能不足,不能激发有效的抗肿瘤免疫应答。近年,免疫细胞过继转移治疗取得长足进展。笔者认为α-gal可联合细胞免疫治疗提高抗肿瘤疗效。一方面,可利用α-gal表位提高肿瘤免疫原性,诱导新型特异性DC-CTL疫苗,重建患者免疫功能;另一方面,可通过“病毒-基因”疗法诱导自体肿瘤组织表达α-gal表位,转变为自体瘤苗,为DC-CTL疫苗提供体内治疗的靶点,在识别、提呈和效应多个环节增强抗肿瘤免疫应答效果。研究目的：1)通过诱导肿瘤细胞或组织表达α-gal表位来解决肿瘤抗原免疫原性低的难题,为启动抗肿瘤免疫应答奠定基础。2)研发新型特异性DC-CTL疫苗,为增强细胞过继转移治疗的疗效奠定基础。3)初步探讨工程化α-gal瘤苗联合新型DC-CTL疫苗治疗结直肠癌的可行性和治疗策略,为进一步完成临床前研究和临床应用奠定基础。研究方法：1)通过质粒重组、病毒包装构建调控GGTA1基因表达的实验慢病毒Lenti-GGTAl和对照空转病毒Lenti-control,体外感染人结肠癌细胞SW620和人胃癌细胞BGC823,建立稳定表达α-gal表位的细胞瘤苗,Western Blot鉴定基因表达产物,荧光显微镜观察α-gal表位的定位表达情况,流式细胞术检测阳性表达率。2)通过质粒重组、病毒包装构建E2F-1启动子调控GGTA1基因表达的AAV-GGTA1和对照空转病毒AAV-control,同时建立裸鼠荷人结肠癌皮下移植瘤模型,瘤内多点注射AAV-GGTA1,并以AAV-control和PBS作为对照,Western Blot鉴定肿瘤组织内融合蛋白表达,冰冻切片间接免疫荧光染色观察α-gal表位表达。3)取健康人外周血分离PBMC培养DC和CTL,分别用普通结肠癌细胞抗原(SW620-normal)、对照慢病毒感染后的结肠癌细胞抗原(SW620-control)和α-gal修饰的结肠癌瘤苗抗原(SW620-a-gal)致敏DC,进一步激活CTL,流式细胞术检测DC和CTL细胞表型,ELISA检测DC分泌的IL-12、IL-10以及CTL分泌的TNF-α、IL-4, LDH释放法检测各组CTL的体外杀伤能力。研究结果：1)经多次酶切、PCR和Western Blot鉴定,Lenti-GGTA1和Lenti-control构建成功,符合实验用滴度。以MOI 200感染SW620细胞、MOI 40感染BGC823细胞,成功建立人结肠癌细胞瘤苗SW620-α-gal和人胃癌细胞瘤苗BGC823-α-galc通过荧光显微镜可以观察到α-gal表位表达于细胞膜上,实验组阳性表达率高达97%。2)经多次酶切、PCR和测序鉴定,AAV-GGTA1和AAV-control构建成功,滴度符合实验需要。建立裸鼠荷人结肠癌皮下移植瘤模型成功率100%。Western Blot检测实验组肿瘤组织内有融合蛋白表达,间接免疫荧光染色可以观察到肿瘤组织中广泛表达α-gal表位。α-gal修饰的结肠癌抗原致敏的DC疫苗CD80和HLA-DR表达升高,CD86表达有升高趋势,CD83表达降低,分泌IL-12增加,分泌IL-10降低,以其激活的CD8+T细胞、NKT细胞比例增加,Treg细胞比例降低,分泌TNF-α增加,体外靶向杀伤能力增强。研究结论：1)体外实验中,所制备的慢病毒可以诱导人肿瘤细胞广泛稳定表达α-gal表位,提高肿瘤细胞免疫原性。2)体内实验中,所制备的AAV可以在体感染人结肠癌肿瘤组织,使其广泛表达α-gal表位,转变为自体瘤苗,提高肿瘤组织免疫原性。3)可以利用α-gal修饰的结肠癌细胞抗原制备DC疫苗,该方法可有效激活第二信号系统,使DC活化程度提高,分泌IL-12的功能增强,分泌IL-10的功能减低;该DC疫苗可以在体外诱导出强有力的CTL,其CD8表达增加,NKT细胞比例增加,Treg细胞比例降低,分泌TNF-α的能力增强。