前言支气管哮喘是一种气道慢性炎症性疾病,它和气道的炎性细胞和结构细胞以及细胞因子等有关。1990年,我国儿科哮喘协作组对27个省市0-14岁儿童进行调查,显示我国儿童哮喘的患病率为0.09%-2.60%,平均0.91%。2000年再次调查结果为0.12%～3.34%,平均1.54%,较10年前平均上升了64.84%。哮喘使很多患者日常生活受到不同程度的影响,据WHO估计,全球由于哮喘导致的调整伤残生命年数量估计达到1500万,约占全球总医疗负担的1%。由哮喘所带来的经济负担无论从住院和药品使用等直接医疗费用还是误工及非正常死亡等造成的间接非医疗费用都相当大。尽管多种新的治疗措施和方法已经在临床证实了确切的疗效,但是还有很多的问题需要解决。一方面很多的治疗并没有触及哮喘的根本,不能起到逆转治疗的效果。另一方面一些治疗手段还有不同的副作用,有的还需要不断地进行药物监测,给患者造成了极大的不便。因此,不断探索研究出更新的更有效的治疗手段是当前迫切的方向,其中从支气管哮喘病因这个源头去发现和探讨疾病的治疗方法或许是一个不错的选择。新的证据显示,维生素D不足可以引起包括哮喘在内的多种肺部疾病,这有可能是与肺功能受损而导致了感染和炎症的发生率增加有关。这种现象的内部机制尚不清楚,但是维生素D会影响炎症和结构细胞的功能,包括淋巴细胞、树突状细胞、单核细胞和上皮细胞。羟化酶负责终止和限制25羟基维生素D3(25-hydroxyvitamin D3,25D3)以循环和储存的形式活化合成1,25二羟基维生素D3(l,25-hydroxyvitamin D3,1,25D3)。2008年,Hansdottir等报道了呼吸道上皮细胞表达1α-羟化酶,后者可以将维生素D活化,而维生素D本身会影响其驱使基因的表达水平,并在机体内发挥着重要的防御作用。1a-羟化酶在呼吸道上皮细胞中的表达表明维生素D在呼吸系统疾病中起着很普遍的影响。呼吸道上皮细胞不仅是物理屏障,也可以分泌细胞因子,例如发挥免疫应答作用的胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)。TSLP是一种白介素-7(interleukin-7,IL-7)类似的新型细胞因子,TSLP作为肺内的一种多效性的细胞因子,在变应性炎症和哮喘中起着重要的作用。最近的研究已经着眼于TSLP产生机制,这有助于我们阐明TSLP如何支气管哮喘发生和发展中起作用的。现已证实,哮喘中存在TSLP基因在呼吸道上皮细胞中的过表达,TSLP在过敏反应免疫应答的发生和发展中起着重要的作用。在SCC25(human oral squamous carcinoma cell, SCC25,人上皮肿瘤细胞,由鳞状细胞癌衍生而来)中,TSLP的表达是由1,25D3诱导的。另有证据显示,局部应用1,25D3可以诱导小鼠表皮角质形成细胞中TSLP的表达使其增加。然而,维生素D是否会影响TSLP在人支气管上皮细胞(human bronchial epithelial, HBE)这一特定的细胞中表达尚不清楚。维生素D3上调蛋白(vitamin D3upregulated protein1,VDUP1)是硫氧还原蛋白的内源性抑制剂,它和维生素D发挥作用密切相关。VDUP1最初被认为是经由1,25D。处理过的白血病细胞(human promyelocytic leukemia cells, HL-60cells)的差异表达基因。该蛋白定位于胞质,在多种细胞反应中发挥着多种作用。最近的研究证实,VDUP1可以介导血管内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素1β信号转导通路。然而,VDUP1在支气管上皮细胞中的表达及其在这个细胞中的活化参与也鲜有人知。本研究旨在利用16-HBE细胞证实维生素D是否增强了TSLP在该细胞中的表达,以及在此过程中是否有VDUP1的参与,为探明支气管哮喘发生机制和治疗提供参考。材料和方法细胞培养和处理、转染16-HBE支气管上皮细胞在MEM培养基中培养,辅以10%胎牛血清,5%C02,37℃恒温潮湿培养箱培养。细胞培养至少两天(70%-80%融合),在刺激前分别用与不用25D3和1,25D3预处理6h后,给予1000nM伊曲康唑刺激2h。VDUP1靶向小干扰RNA (SiRNA)序列如下SiRNA1:上游5’-GUCAGAGGCAAUCAUAUUATT-3’,下游5’-UAAUAUGAUUGCCUCUGACT G-3’; SiRNA2:上游5’-CUGUGAAGGUGA UGAUAUUTT-31,下游5’-AAU CUCAUCACCUUCACAGTT-3’;SiRNA3:上游5’-GAAACAAAUAUGAGUACAATT-3’,下游5’-UUGUACUCAUAUUUGUUU CCA-3’; Negative control (NO:上游5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’,下游5’-ACGUGACACGUUCGGAGA ATT-3’=16-HBE细胞置于12孔培养板中培养两天,调整细胞浓度至每孔1.2×105个。待细胞融合40%-60%时,用5nM VDUP1特异性SiRNA和HiPerFect转染试剂对照SiRNA进行转染。以MTT法测定细胞活力。经转染的细胞另培养48h,用500nM的25D3和50nM的1,25D3分别刺激6h。使用1,25D3的酶联免疫测定试剂盒进行1,25D3定量RNA的分离提纯和RT-PCR以RT-PCR技术分析基因的表达和Mx3005p实时定量PCR (qPCR)系统进行分析。提取总RNA后,用RNA iso PLUS试剂盒。用Prime ScriptTM的RT试剂盒将RNA合成为500ng cDNA。该定量RT-PCR反映混合物中含有1*SYBR与ExTaq预混物、200nM正向和反向引物,并在25μL终体积中加入2μL的cDNA。使用的引物分别为：人TSLP(上游：5’-GCCCAGGCTATTCGGA AAC-3’,下游：5’-GAAGCGACG CCACAATCC-3’), VDUP1(上游：5’-ACTCGTGTCAAAGCCGTTAGGA-3’,下游5’-AGCTCAAAGCCGAACT TGTACTCA-31),β-actin(上游：5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’,下游：5’-GAAAGGGTGTAACGC AACT-3’)。通过CT(循环阈值：每个反应管内的荧光信号达到所设定的阈值时,所经历的反应循环数)值来计算mRNA的相对表达水平。以β-actin为内参来进行RNA定量。Western Blot分析细胞用PBS洗涤三次,在O℃裂解液中裂解。用Bradford蛋白测定法测蛋白质浓度。以10%SDS聚丙酰胺凝胶(每泳道40mg蛋白)电泳,转膜至PVDF膜。以5%脱脂奶的TBST液室温封闭1h,兔抗人VDUP1多克隆抗体4℃孵育过夜。TBST洗膜(3×15min),1:5000辣根过氧化物酶孵育,室温抗兔IgG二抗孵育1h。Super ECL系统经由X线检测蛋白质信号。TSLP的酶联免疫吸附试验(ELISA)上清液中通过ELISA法检测(Bradford总蛋白标准化定量)测定TSLP。最低检测检测水平为31.25pg/mL统计方法数据采用(平均值±标准差)表示。组间差异用单因素方差分析法；以Bonferroni法进行多重比较。用单侧或双侧t检验单独比较两组间差异。P<0.05示有统计学差异。结果1、25D3诱导16-HBE细胞TSLP的表达不同浓度的25D3(50-1000nM)处理后,16-HBE细胞的细胞活力没有受到任何影响。根据剂量-效应曲线,TSLP的mRNA水平在25D3的100nM浓度时显著增加。并且随着25D3的浓度增力P,TSLP的nRNA水平不断增加,在500nM处达到峰值。因此,500nM浓度被选做后续实验。时间-反应结果表明(刺激条件：500nM25D3,持续2-24h)TSLP的mRNA表达和蛋白质的水平显著上调。2、25D3诱导16-HBE细胞VDUP1的表达25D3刺激0.5-24h后,细胞内VDUP1的mRNA和蛋白质的表达水平。结果表明,与对照组相比,500nM25D3刺激2-24h后,细胞内VDUP1的mRNA表达和蛋白质表达水平显著上调。3、下调VDUP1的蛋白表达针对VDUP1合成了三种siRNA (siRNA1和siRNA2, siRNA3)(详见材料与方法)。从转染的siRNA2或siRNA3的细胞裂解液中发现VDUP1水平降低。这种现象在siRNA3中更加明显,与对照组相比,VDUP1的表达减少了35%,VDUP1siRNA3被选做后续实验。4、VDUP1的沉默降低了在16-HBE细胞中25D3介导的TSLP的合成采用VDUP1siRNA来抑制16-HBE细胞中VDUP1的表达。用siRNA转染的细胞存活率大于90%。在同样浓度D3(500nM)刺激下,经siRNA处理后的VDUP1沉默的细胞,其TSLP的mRNA和蛋白表达水平都有显著降低。5、la-羟化酶抑制后限制了16-HBE细胞中25D3活化为1,25D3,并且减弱了TSLP的表达25D3存在时,16-HBE细胞可以不经任何刺激的情况下,将25D3活化为1,25D3。经1000nM伊曲康唑预处理的16-HBE细胞,25D3活化为1,25D3的能力显著降低。在1000nM伊曲康唑预处理后,由25D3介导的TSLP的mRNA和蛋白水平显著降低。6、VDUP1的沉默降低了16-HBE细胞中1,25D3介导的TSLP的表达水平不同浓度的1,25D3(0.1-100nM)中,16-HBE细胞活力没有变化。根据剂量-效应曲线,1,25D3在0.1nM处,TSLP的nRNA和蛋白水平显著增加,并在50nM处达到峰值。而当同样在50nM浓度的1,25D3时,TSLP的mRNA和蛋白质的表达水平在2h时显著增加,并在12h处达到峰值。50nM浓度的1,25D3刺激6h后,测得、/DUP1的mRNA的表达水平。结果表明,在16-HBE细胞中,与对照组相比,在50nM终浓度的1,25D3刺激6h后,VDUP1的mRNA的表达显著上调。与对照组siRNA处理过的细胞相比,经由50nM浓度的1,25D3处理后的细胞,当VDUP1基因沉默表达时,其TSLP的mRNA和蛋白水平显著降低。以上结果显示,在16-HBE细胞中,1,25D3是经由VDUP1通路介导TSLP的表达。7、1a-羟化酶的抑制对在16-HBE细胞中1,25D3诱导的TSLP表达水平没有明显的影响1000nM的伊曲康唑预处理16-HBE细胞,仍然会有1,25D3介导生成TSLP。这进一步支持了16-HBE细胞在维生素D活化并介导TSLP表达通路中,1α-羟化酶并未发挥作用。结论1、非活化的25D3和活化的1,25D3都可以介导16-HBE细胞中TSLP的表达；2、1α-羟化酶经伊曲康唑抑制后,部分抑制了25D3(而不是1,25D3)的TSLP在16-HBE细胞中的表达；3、与25D3相比,极低浓度的1,25D3更能显著增加TSLP在气道上皮细胞中的表达；4、维生素D对TSLP基因表达的影响是间接的。