研究背景细胞外微囊泡(extracellular vesicles,EVs)是一种由细胞分泌的纳米级颗粒,其携带着蛋白、RNA等重要生物学信息并来源与相应细胞。越来越多的研究显示EVs参与多种不同的生理及病理过程,例如参与了细胞间的通讯、清除细胞内废弃的蛋白、参与了体内免疫机制的调节。此外还具有本身特异性生物标志物,有望成为疾病诊断及疗效监测的新型标志物。由于对其研究的不断深入,人们对于EVs的生物化学信息了解的要求越来越高。人类体液中例如尿液、血浆、妊娠时的血清、支气管灌洗液、关节滑液、唾液、母乳、胸腔积液等中都含有EVs。此外许多研究报道多种不同类型细胞均可以分泌EVs,如B淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞、T细胞、血小板、神经细胞、肠上皮细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜细胞、肿瘤细胞及精子等。2004年,Pisitkun团队首次从尿液中成功分离和鉴定出尿细胞外微囊泡(urinary extracellular vesicles,uEVs)。其预测uEVs来源于多种泌尿系统上皮细胞,因为经验证发现了与多种上皮细胞相对应的标志性蛋白,包括肾小球足细胞、近端小管、髓袢髓质厚壁段升支、集合管及膀胱标志物。根据uEVs密度、大小、特异性标记物等方面差异,其包括多种不同类型。利用目前被大部分人认同的分类方法,根据uEVs的大小和分泌方式不同,大体上将其分为3种:第一种为外泌体(exosome),也是目前研究最广泛的一种,exosome的直径约为40～100 nm,属于uEVs中较小的一类;第二种称为微囊泡(microvesicle),目前对于此类微囊泡的直径大小范围意见不一,但大部分研究认为其直径约为100～1000 nm;而凋亡小体(apoptosis body)的直径在1000 nm以上。当前对于uEVs的研究,仍处于初级阶段,想要实现最终的临床应用,仍需解决很多面临的难题。其中包括目前对于EVs的分类和定义并无达成一致共识,2012年4月在瑞典哥德堡举行了国际微囊泡会议上,主持人便强调了对EVs的认识、命名及分类的重要性。尽管在会议上并没有得到广泛的认同,但是仍然达成了一些共识,其中包括在对EVs还无法完全定义和命名前,建议关于微囊泡的文章用EVs表达。目前关于uEVs的研究中采用的尿液标本绝大多数为晨尿或随机尿,这主要是受到了uEVs分离方法的限制。但是前期已有相关报道提示,个体间单次尿液中uEVs量已经存在较大差异,研究提示uEVs分泌有昼夜规律。因此对24小时uEVs的总体分泌情况进行分析是非常有必要,这样有助于我们对健康人uEVs的分泌情况有更全面地了解。而对24小时分泌的全部uEVs进行分离和分析,目前国内外尚无针对性的报道。在不断探索并试图识别疾病生物标志物的过去10年中,蛋白质组学技术开发和优化得到了快速的发展。尿液可以很容易地用于临床以及基础研究,因为尿液具有获得简单,非侵入性、足够和稳定的特点。基于uEVs的研究,能很好地解决含量多杂,稳定性差,结果波动度大的弊端。但目前仍缺少通过蛋白质组学分析不同性别间尿vesicles蛋白差异的相关报道。大量研究报道已表明在不同疾病的发病率上存在明显的性别差异,且不同性别尿中含有的蛋白质的种类及数量均不相同。因此在对于探讨疾病生物标志物前,我们应先对于不同性别的蛋白质差异有初步的了解。这有助于我们更好地去分析比较疾病间差异的蛋白的表达情况。但目前仍缺少通过蛋白质组学分析不同性别间尿vesicles蛋白差异的相关报道。针对上述研究空缺情况,本研究通过近期国际上报道的液压透析滤过法,成功对健康成人24小时全部尿液中的uEVs进行提取、分析。第一次报道健康成人24小时uEVs含量、大小分布及个体间差异。同时本研究通过团队成员3年来的不断摸索,探讨出的通过液压透析法联合还原-烷基化-Trypsin酶解反应对uEVs成功进行了富集及纯化,进一步的质谱分析,了解uEVs及其外部差异蛋白,对所得样本进行蛋白质组学分析,首次分析24小时uEVs中蛋白成分及男女间蛋白含量的差异。材料和方法1.1尿标本的留取年龄在22～63岁(中位数年龄为49岁),9名健康成年人,所有入选志愿者经空腹胰岛素、血糖、尿常规、24小时尿微量白蛋白定量、24小时尿蛋白定量、血清肌酐检测及eGFR评估等检查结果提示无糖尿病、肾脏病等慢性病史,在24小时尿液留取前2周内无急性感染、无药物使用史,女性避开月经期,标本留取中使用甲苯作为防腐剂(本团队前期已验证甲苯不会破坏uEVs)。1.2 uEVs的分离和富集对收集到的9份24小时尿标本使用液压透析滤过法对24小时uEVs进行分离以及富集,具体步骤如下:(1)首先,经过低速离心(2000 g,30 min)可除去尿液中方大部分Tomm-Horsfall蛋白以及细胞、细胞碎片等;(2)进行透析滤:过上清液在离心后倒入1OOOKDa(截留的相对分子质量)的透析膜装置中;(3)当透析膜中尿液只剩余6～8mL时,用200 mLmiliQ water冲洗透析膜装置;(4)待透析膜装置中的尿液再次剩余至15～20mL时,收集透析膜装置中富集的uEVs样品,并对每份分离富集到的uEVs样品进行定容,终体积为20 mL。1.3BCA蛋白法采用96孔板、BCA试剂盒作为本研究中蛋白定量分析方法。步骤为:取一定量的BSA标准品,用PBS进行稀释,最终配成如下浓度梯度的standing BSA溶液:0、6.25、12.5、25、50、100、200以及400μg/mL。将与PBS混匀后取BSA溶液及uEVs样本溶液20 μL进行加样。最后,每孔加入200μL的工作液进行混匀,置于37 ℃温箱中孵育,孵育时间:30 min。孵育结束后,冷却样本到室温,使用酶标仪进行读数,波长设置为562 nm。1.4 Western blot(WB)本实验采用垂直板形电泳方法,连续凝胶系统,凝胶浓度:15%,Tris-甘氨酸缓冲液(电极缓冲液)。样品液先在沸水中浴15 min,然后根据每个样本量为30 μL向电泳槽中上样。设置电泳为恒定电流20mA每块胶进行,终止电泳前可观察到:溴甲酚蓝指示剂只凝胶底端0.5～1 cm,停止电泳。取出凝胶浸泡至转膜液中,使用0.22nm硝酸纤维膜对凝胶中蛋白进行转膜,设置转膜为恒定电流150mA每块胶,时间为2小时。转膜结束后,用TBST洗涤3次,每次10 min,之后用3%BSA封闭液封闭过夜(至于4 ℃冰箱中)。封闭液甩去后,使用TBST洗膜液体洗膜3次,每次时间:5 min;将膜浸泡入含有抗体的缓冲液中(稀释一抗比例为1:250)。37 ℃进行孵育2 h,一抗选用家兔抗人抗体TSG101,Tumor Susceptibility Gene101进行过夜孵育。过夜后甩去一抗,用TBST洗涤3次,每次10 min,然后加入1:5000比例进行稀释的二抗,室温孵育1h(山羊抗家兔抗体为二抗)。之后甩去二抗,用PBS液洗膜3次,每次1Omin。加入曝光液A、曝光液B各1 mL(按1:1比例进行混合);之后将取出硝酸纤维膜取出,放在与ODC仪器上进行定影及扫描。1.5透射电镜20～30 μL uEVs被取出沉淀于载样铜网上进行悬液处理,室温下静置时间为:2 min,用滤纸从侧面吸干液体,之后滴加约4%磷钨酸溶液30μL于铜网上,室温下负染2 min。使用滤纸将负染液吸干,同时放置于白炽灯下烤干,时间约10 min,之后在电压80kV条件下使用电子显微镜PHLIPS—TECNAI 10进行观察照相。1.6 NanoSight 300纳米微粒跟踪分析(NTA,Nanoparticle tracking analysis)纳米微粒跟踪分析技术的可检测范围在107～109 particles/mL,本实验取健康成年人的24小时尿样品(共9份),按1:1000比例通过miliQ水稀释成1 mL,之后使用NanoSight 300(NanoSight,Malvem,UK)进行定量测量,温度为23.7 ℃。设备数据为测量时间为60 s,25帧/s,本设备通过运用囊泡的布朗运动原理,具有对提供样品进行可视化以及检测近似囊泡浓度的功能。实验最终可以得到24小时尿液中囊泡的浓度和基于囊泡大小的2D(二维)分布图像。本研究在对NTA的设置进行优化的情况下,在测量不同样品时,保证参数不变,分析样品的不同囊泡大小亚群的分布情况以及囊泡的近似浓度。1.7在对24小时uEVs纯化的基础上,对uEVs相关蛋白指纹图谱进行分析检测对尿液通过“液压透析法”富集方法后得到的24小时uEVs样品(男性2例,女性两例),通过还原、烷基化反应和Trypsin酶解的反应方法进行24小时uEVs纯化。然后通过去污剂--脱氧胆酸钠的作用下破坏uEVs的外膜,暴露uEVs的内部成分,特别是蛋白成分,再通过烷基化、还原以及Trypsin酶解的方法,之后利用质谱的方法分析并了解uEVs相关蛋白图谱,分析不同样本间蛋白的差异。1.8统计学处理最终数据经SPSS 19.0软件进行分析计算,计量资料用均数标准差表示,应用率表示计数资料,个体间差异用变异系数CV进行表示。(标准偏差/平均值)×]00%为变异系数的计算公式。结论1.本研究应用新型uEVs分离、富集方法,首次对健康成人24小时尿液中的所有uEVs进行富集、分离、及除杂的过程,通过验证本方法可得到完整性好,足量的uEVs标本用于之后的分析研究。本方法适用于不同实验室、不同人群以及不同尿液生理及病理状态下对于uEVs的研究,本方法是一种值得广泛推广、应用的技术方法,具有设备简单、操作方便,重复性高的特点。2.利用本团队研究方法成功对24小时uEVs进行提取,同时对健康成人24小时尿液中uEVs的大小分布、分泌总量、个体间差异等情况进行了综合检测和分析。健康成人分泌的24小时uEVs个体间差异较小,是uEVs相关研究较理想的标本来源。符合微囊泡范围的直径在100～1 OOOnm的囊泡占人体分泌的uEVs的主要部分。3.通过对24小时uEVs的蛋白质组学分析,鉴定出可靠健康成人的uEVs相关蛋白质图谱,并在此基础上比较得出不同性别间uEVs蛋白种类存在差异。提示在关于尿微囊泡的蛋白组学分析中应注意性别不同引起的蛋白差异表达。