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二代测序技术(Next Generation Sequencing,NGS)又称高通量检测技术,在临床医学检测中具有广泛应用。该技术允许同时对多种病原微生物的基因组序列进行测序,这些序列既可以来自不同患者的微生物分离株,也可以来自同一患者样本的多重感染。此外,该技术通常被认为是用于细菌阵列综合评估的最有效方法。但对于区分混合物种中丰度极低的病原体,仅使用二代测序分析得到的读取序列少,容易出现误差,因此可以在测序之前进行PCR扩增。因此本研究根据CHINET中国细菌耐药监测结果(2017年)的统计分析,选择高频出现在混合感染临床样本中的22种病原菌(其中包括19种细菌和3种真菌)作为研究目标,为准确检测临床标本中的上述多种病原体,开发了一种基于多重PCR(multiplex PCR,m PCR)联合二代测序的高通量检测技术(m PCR-NGS)。我们对22种临床病原体设计了44对引物,这个Primer mix称为“临床病原体面板”(Clinical Pathogens Panel,CPP)。CPP被设计用于在Illumina Hi Seq 2500平台上进行测序,以上22种靶向病原体均能产生特异性读数。首先将22种临床病原菌的核酸作为模板,使用常规PCR对44对引物进行扩增,结果显示所有的引物具有良好的特异性和敏感性。再通过多重PCR扩增和二代测序评估了CPP的均一性,结果显示引物浓度调整前的均一值落在0～8.70之间,调整后的均一值落在0.33～2.37之间,调整前与调整后CPP的reads有显著差异(P<0.001),证明引物的浓度调整有明显效果。接下来将浓度调整后的CPP作为引物,对多重PCR扩增体系分别采用19、22、25和28个循环数进行扩增,结果显示引物二聚体随着循环数的增加而增加,但二聚体含量不足以在琼脂糖凝胶电泳实验中显示,可排除引物二聚体对CPP的影响。因此,多重PCR的循环数在19～28之间均可用。然后采取12种破碎方案分别对典型的革兰氏阳性菌(Staphylococcus aureus、Enterococcus faecium)、革兰氏阴性菌(Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli)和真菌(Candida albicans)进行物理破碎。结果显示,病原菌浓度在1 OD以下时,可选择0.5 g(0.1mm:0.5mm=1:1)玻璃珠对病原菌进行物理破碎,破壁率>95%。接下来通过q PCR对市售三种不同试剂盒进行核酸提取效果比较,结果显示选择使用Mag Pure Circulating DNA Kit B与核酸自动化提取仪搭配效果最好。并且在使用物理破碎的基础上,仅在低浓度的S.aureus上需再进行酶解,此时提取到的核酸与未加酶提取的核酸有显著性差异(P<0.05)。此外,使用上述物理破碎条件和核酸自动化提取平台对10~6,10~5,10~4,10~3,10~2 cfu/m L的金黄色葡萄球菌(S.aureus)、白色念珠菌(C.albicans)分别进行核酸提取,结果显示在病原菌浓度为10~6 cfu/m L时,S.aureus和C.albicans的核酸提取效率分别达85%、90%以上;并且在病原菌浓度10~6～10~2 cfu/m L之间时,C.albicans的核酸提取效率随着浓度的降低而降低;S.aureus的提取效率整体降低,在10~4 cfu/m L时,S.aureus的核酸提取效率最低为11.3%。最后,对五种病原体对应的10种DNA片段进行多重PCR和二代测序检测,理论上,基于多重PCR和二代测序的多物种自动化检测平台的检测下限为133 cfu/m L。并且对11例痰样本进行基于多重PCR的二代测序检测,临床培养的阳性率为72.73%(8/11),m PCR-NGS的阳性率为100%。其中只有1例是单一感染,其他均为混合感染。其中出现率最高的是嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(7/11)。以及对11例血液样本进行基于多重PCR的二代测序检测,结果显示该方法的敏感性高于q PCR、Sanger测序以及临床培养。总而言之,我们的工作表明基于多重PCR的NGS技术(m PCR-NGS)可以检测临床样本中的22种病原体。CPP的NGS结果与扩增子的初始浓度有一定的相关性。并且该方法具有如下优点:首先,它可以用于临床病原菌的定性和定量检测;此外,它可以识别同一样本中的优势和非优势物种;最后,将CPP用于临床诊断可以减少分析时间和成本,因为可以同时检测多个样本和不同的病原体基因。