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乙草胺(acetochlor)是我国使用最多的3种除草剂之一,属于酰胺类除草剂。其化学性质稳定,在自然条件下不易挥发和光解,易残留,市场消耗大、使用范围广,美国环保局(USEPA)及欧盟环保署(EUEPA)已将其列为2-B类致癌物及可疑的内分泌干扰物。我国农业部注册生产乙草胺的企业有32家之多,乙草胺职业性接触人群较多,而国内外尚无乙草胺工作场所的浓度限值标准。乙草胺残留引起的生态环境问题及其对人类健康的影响越来越受大众关注,其毒性作用及致毒机理也是国内外学者的研究热点。目前对乙草胺的研究多集中在环境行为方式的评估、环境残留和以及其分解过程上,毒性研究也大多集中于非哺乳类动物,对哺乳类动物特别是小鼠的毒性作用研究较少,对小鼠雄性生殖系统影响的报道更是少见。本研究用C57BL/6小鼠和GC-1精原细胞株从体内、体外二个层面对不同剂量乙草胺致雄性小鼠的系统毒性及生殖毒性进行分析,用GC-1精原细胞进行毒性验证及研究其毒作用发生的可能分子机制,系统地探讨乙草胺对雄性小鼠的毒性作用特别是生殖系统毒性,为乙草胺相关标准的制定及乙草胺职业接触人群的防护提供新的理论基础。研究目的:建立动物乙草胺亚急性染毒模型和GC-1小鼠精原细胞乙草胺染毒模型,分析乙草胺对小鼠系统及生殖系统毒性的影响,探讨乙草胺诱导氧化应激、内分泌作用失调与生殖细胞退行性病变和细胞凋亡之间的关系。研究方法:体内实验:SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分对照组以及250 mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg三个染毒组,每组10只。各染毒组分别每日给予250 mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg乙草胺灌胃,Control组以玉米油灌胃,每日1次,连续给药30天,制成亚急性染毒模型。每周监测并记录小鼠体重。第30天染毒结束后,将小鼠处死,取血检验小鼠血生化及睾酮水平,各脏器进行脏器系数分析,睾丸组织做氧化应激相关指标测定和病理切片的制作,附睾中取小鼠精子检查精子畸形率。体外实验:CCK-8细胞计数试剂盒检测不同浓度乙草胺作用12h后的GC-1精原细胞活力,LDH释放实验检测乙草胺对细胞的毒性作用,SOD、GSH、MDA检测细胞氧化应激反应的程度,AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平,观察乙草胺对GC-1精原细胞的损伤情况。Western blot技术检测JNK/SAPK、p38、p44/42(ERK1/2)、p53、Bax、Bcl-2、caspase 3及caspase 9等相关蛋白的表达,以提示乙草胺致细胞凋亡的可能机制。研究结果:1.乙草胺对C57BL/6小鼠的系统毒性给药组小鼠随着乙草胺给药剂量的增加、给药时间的延长,出现活动减少、毛发光泽度消失、进食量明显减少等表现。体重总体上呈增加趋势,但随着给药浓度的升高体重增加量减少。心、肝、脾、肾、附睾的脏器系数随着染毒浓度的增加而升高。与对照组相比,三个染毒组的BUN和CREA水平显著降低(P<0.001);500mg/kg和1000 mg/kg组的CHO水平显著升高(P<0.001);ALT,AST,TG浓度只有1000mg/kg组明显升高(P<0.001);TP,ALB,GLU的水平与对照组比无明显改变。2.乙草胺对小鼠生殖系统的影响乙草胺各染毒组小鼠血清中睾酮水平显著上升;睾丸组织中SOD水平逐渐下降,MDA呈上升趋势,而GSH水平总体呈降低改变;睾丸组织病理上呈进行性退化病变,可见精子数量减少,生精小管排列紊乱、层次减少和明显空泡化等改变;小鼠精子畸形率升高。3.乙草胺对GC-1精原细胞的影响经乙草胺处理后的GC-1精原细胞细胞活力降低,IC50为4.80×10-4M;细胞毒性总体呈上升趋势(P<0.05),10-3M组的细胞毒性约为对照组的4倍;SOD、GSH水平呈梯度降低趋势(P<0.05),MDA水平随着乙草胺染毒浓度的升高而显著增加;各染毒组细胞凋亡率呈梯度上升趋势(P<0.01)。4.乙草胺可能通过ERK-p53-Bcl-2级联反应介导凋亡通路影响精原细胞Western blotting检测乙草胺处理的GC-1精原细胞中相关通路蛋白:乙草胺染毒可显著降低GC-1精原细胞p44/42(ERK1/2)的表达,增加促凋亡蛋白Bax蛋白的表达,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,并激活下游凋亡级联反应,caspase3、caspase9蛋白表达增多。此外,p53蛋白的表达呈剂量反应性升高,而各组中JNK/SAPK和p38的表达没有明显改变。综上所述,乙草胺可能通过氧化应激调节ERK-p53-Bcl-2级联反应介导凋亡通路影响精原细胞生存。研究结论:1.乙草胺对C57BL/6小鼠具有系统毒性。2.乙草胺对C57BL/6小鼠、ICR小鼠具有生殖系统毒性。3.乙草胺对GC-1精原细胞有明显的细胞毒性作用,乙草胺可能通过氧化应激调节ERK-p53-Bcl-2级联反应介导凋亡通路影响精原细胞生存。