弯曲杆菌(Campylobacter)是一种革兰阴性、呈弧形、无牙孢、苛养性细菌,该菌易导致人细菌性胃肠炎。弯曲杆菌病具有潜伏期短、感染率高和病程长等特点。人类患弯曲杆菌病通常是食用未煮熟的牛肉或饮用弯曲杆菌污染的水和牛奶,从而导致人类食源性疾病。抗生素药物的滥用会导致耐药性传染病菌株的出现,危害公共卫生并造成更大的社会经济负担。本研究先通过微生物学及分子生物学方法在宁夏地区分离鉴定牛源弯曲杆菌,再用反向免疫学方法鉴定候选疫苗蛋白,最后对蛋白FlgH原核表达和抗原性分析。对宁夏部分牧场样品采集,其中奶样136份、腹泻牛粪样品32份、肠管6份;通过分离培养、生化试验检测、PCR检测及测序,鉴定细菌和毒力基因检测。结果显示:136份乳样中分离出3株空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni,C.jejuni),其阳性为2.2%;腹泻粪样中分离出4株结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli,C.coli),其阳性率为12.5%。本研究应用Vaxign、VaxiJenv2.0和BCPreds软件预测候选疫苗抗原。用于筛选免疫性蛋白的主要标准是蛋白的定位、抗原性和B细胞抗原表位数。结果显示空肠弯曲杆菌中20种作为潜在疫苗的蛋白进行预测,最后新发现4个蛋白(其中两个细胞外蛋白FlgK、FlgE;两个膜外蛋白FlgH、假设蛋白Cj1252)适合用作疫苗研究。从上述鉴定出的候选疫苗蛋白中,选择了鞭毛蛋白FlgH进行原核表达和免疫原性分析。设计出扩增FlgH基因全长引物,并以空肠标准菌株11168(NCTC 11168)为模板进行PCR扩增,目的条带进行胶回收酶切后与提取并酶切后的载体质粒pET-32a(+)进行连接;重组质粒pET32a(+)-flgH转化感受态细胞BL21,并用LB(含AMP)培养基进行分离和富集扩增。随后应用IPTG诱导表达并找出合适的诱导浓度及诱导时间,应用SDS-PAGE分析,最后纯化蛋白。His-FlgH纯化蛋白通过三种接种途径(背部皮下、腿部肌肉和腹腔)免疫6周龄ICR小鼠,经过一次纯化蛋白与完全佐剂免疫和两次纯化蛋白与非完全佐剂免疫后收集小鼠血清,采用间接ELISA检测多抗血清效价,Western bolt分析显示多抗血清能够与重组蛋白His-FlgH特异性结合。结果表明皮下和肌肉组多抗血清效价为25600,大于腹腔组的多抗血清效价12800;FlgH的原核表达产物具有一定生物学活性。所以进一步证明其作为亚单位疫苗的可能性,也为下一步该蛋白疫苗应用于宿主和检测其免疫保护性的实验提供了理论基础和试验依据。弯曲杆菌病疫苗是防止弯曲杆菌感染人和宿主动物的干预措施,从而有效地降低动物的发病率。