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椎间盘退行性病变是引起腰背部疼痛、导致劳动能力丧失的主要原因,给社会经济带来沉重负担。过度力学刺激引起的炎性反应是导致纤维环变性、引发椎间盘退变的主要因素之一。近期研究表明,适度力学刺激能调控纤维环基质代谢,改善纤维环炎性微环境,但其机制尚不清楚。YAP作为力学敏感蛋白,可将力学信号转化为生物信号,进而调控细胞代谢及生长,在多种力学介导的生理、病理过程中扮演着重要角色。因此,本研究将深入探讨适度力学刺激对纤维环炎性反应的影响以及YAP在其中的作用机制。本论文主要分为三个部分进行研究,首先考察了通过幅度为5%和12%的周期性拉伸应变(CTS)施加的力学刺激对纤维环细胞的影响,筛选出适度力学刺激;然后以IL-1β诱导的纤维环细胞炎性模型为研究对象,进一步验证适度力学刺激的作用;最后应用YAP抑制剂探讨YAP是否参与适度力学刺激的抗炎效应。本论文的第一部分探究了周期性拉伸应力对纤维环细胞基质代谢的影响。利用酶解法从SD大鼠的纤维环组织中提取并培养纤维环细胞,将纤维环细胞接种于弹性硅胶皿(PDMS)上,分别采用5%和12%的拉伸幅度(拉伸频率0.5 Hz),对其进行24 h的周期性拉伸应力(CTS)刺激。利用骨架染色观察细胞形态;采用EdU染色检测细胞增殖;通过RT-qPCR和Western blot分析合成代谢基因(Aggrecan、Col-Ⅰ和Col-Ⅱ)、分解代谢基因(Adamts5、MMP3和MMP13)及促炎基因(IL-1β、COX-2和iNOS)表达情况。结果显示,在静态培养条件下,纤维环细胞呈扁平的多边形细胞形态,生长方向无规;而在5%CTS组中,细胞倾向于沿拉伸方向伸展;在12%CTS组中,细胞形态变细,且主要沿垂直于拉伸方向排布。通过EdU染色发现,在5%CTS组中纤维环细胞的增殖水平最高,比对照组高8.2%,比12%CTS组高13.9%。RT-qPCR结果表明,5%CTS可以促进合成代谢基因(Aggrecan、Col-Ⅰ和Col-Ⅱ)表达。然而,12%CTS下调合成代谢基因(Aggrecan、Col-Ⅰ和Col-Ⅱ)表达,同时能够上调促炎基因(IL-1β、COX-2和iNOS)和分解代谢基因(Adamts5、MMP3和MMP13)表达。Western blot分析进一步证实,12%的CTS可增加基质降解酶(MMP3和MMP13)和促炎因子(iNOS和COX-2)分泌,而5%CTS则促进蛋白多糖的合成。本论文的第二部分探究了周期性拉伸应力对纤维环细胞炎性反应的调控,进一步筛选具有抑制纤维环炎性反应的力学刺激。利用IL-1β诱导纤维环细胞产生炎性反应,然后结合力学加载细胞培养系统分别给以5%和12%CTS处理纤维环细胞。采用EdU检测细胞增殖;通过RT-qPCR分析合成代谢基因(Aggrecan、Col-I和Col-Ⅱ)、分解代谢基因(Adamts5、MMP3和MMP13)及促炎基因(IL-1β、COX-2和iNOS)表达情况。结果显示,5%CTS与IL-1β共处理组中细胞增殖率显著高于IL-11β刺激组,12%CTS和IL-1β共处理组细胞增殖率明显低于对照组。RT-qPCR结果表明,5%CTS显著降低了 IL-1β诱导的促炎基因(IL-1β、COX-2和iNOS)以及分解代谢基因(Adamts5、MMP3和MMP13)表达,同时上调了合成代谢基因(Aggrecan、Col-Ⅰ和Col-Ⅱ)表达。然而,12%CTS显著增强了IL-1β诱导的促炎基因(IL-1β、COX-2和iNOS)和分解代谢基因(Adamts5、MMP3和MMP13)表达且进一步降低了合成代谢基因(Aggrecan、Col-Ⅰ 和 Col-Ⅱ)表达。本论文的第三部分探究了 5%CTS是否通过YAP抑制NF-κB信号通路,调控炎性反应。利用IL-1β诱导纤维环细胞产生炎性反应,然后结合力学加载细胞培养系统给以5%CTS处理纤维环细胞,同时加入YAP抑制剂verteporfin(VP)。采用EdU检测细胞增殖情况;通过RT-qPCR分析合成代谢基因(Aggrecan、Col-Ⅰ和Col-Ⅱ)、分解代谢基因(Adamts5、MMP3和MMP13)及促炎基因(IL-1β、COX-2和iNOS)表达情况;通过Western blot评价YAP、p-YAP、p65和p-p65表达情况;应用免疫荧光染色观察p65核定位情况。结果显示,在YAP被抑制后,5%CTS对NF-κB信号通路活化的抑制作用显著被削弱,表现为p65磷酸化增强。p65的免疫荧光染色结果显示:VP解除了 5%CTS对p65核转位的限制作用,从而导致p65再次定位于细胞核内。此时,促炎基因(IL-1β、COX-2和iNOS)和分解代谢基因(Adamts5、MMP3和MMP13)表达再次升高,合成代谢基因(Aggrecan、Col-I和Col-II)表达降低,细胞增殖率也再次下降。综上所述,我们数据证明5%CTS是一种适度的力学刺激,能够抑制细胞炎性反应,促进细胞增殖和胞外基质的分泌。然而,12%CTS是一种过度的力学刺激,可以抑制细胞增殖、上调炎性水平及降低胞外基质合成。这为临床设计科学有效的康复训练方案提供了理论依据。重要的是,我们揭示了 YAP作为力学转导蛋白参与力学刺激抑制NF-κB信号通路的活化以发挥抗炎效应。这一发现为人们理解脊柱运动康复的益处提供了分子理论基础,同时靶向YAP介导的NF-κB信号通路失活有望成为治疗椎间盘退变的新方法。