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Ⅰ型聚酮类化合物安丝菌素P-3(Ansamitocin P-3,AP-3)是一种微生物来源的美登素类分子,具有很强的抗肿瘤活性。AP-3的生物合成可以分为三个阶段:AHBA(3-氨基-5-羟基-苯甲酸)合成阶段、聚酮链延伸阶段和后修饰阶段。前期研究主要利用培养条件优化和遗传改造等策略来增强AP-3合成水平,但所得产量仍然很低,并且对其生物合成途径的改造方面也鲜有报道。本论文主要通过确定并消除安丝菌素生物合成三个阶段的限速步骤来实现AP-3高产。与Actinosynnema pretiosum subsp.auranticum ATCC 31565和Actinosynnema mirum DSM 43827相比,Actinosynnema pretiosum subsp.pretiosum ATCC 31280的AP-3产量在多种发酵条件下均为最高,因此本研究确定以ATCC 31280作为AP-3发酵生产的出发菌株。通过全基因组测序分析发现,ATCC 31280包含一个8,340,266 bp的环形染色体,其中含有AP-3生物合成所需的全部基因。除AP-3生物合成基因簇外,ATCC 31280染色体中还存在11个PKS类型的生物合成基因簇。与其它常见链霉菌相比,ATCC 31280中负责细胞移动和分泌的基因比例和数量是最多的,暗示该菌有较强的分泌功能。对ATCC 31280的基因组测序和分析为本研究奠定了基础。本论文首先利用前体物定向喂养策略,对后修饰阶段的限速步骤进行了鉴定,并通过过表达限速酶与外源添加前体物的手段,消除了后修饰瓶颈,提高了AP-3产量。在ATCC 31280发酵液中,除AP-3外,氨甲酰化-糖基化AP-3(ACGP-3)也有明显积累。对糖基转移酶基因ansa30进行敲除后,糖基化分支产物ACGP-3消失,而AP-3产量相比野生型提高了66%,达到70±2 mg/L;同时N-去甲基AP-3(N-demethyl-AP-3,PND-3)大量积累,暗示N-甲基化反应可能为限速步骤。进一步利用中间产物定向喂养策略,在PKS突变株中大量喂养后修饰阶段的起始底物19-chloroproansamitocin,增强后修饰阶段的代谢流量,发现中间产物PND-3及N-去甲基-去环氧-美登醇(N-demethyl-desepoxy-maytansinol,DDM)显著积累,确定了N-甲基化为后修饰阶段的限速步骤。通过在突变株NXJ-22中过表达N-甲基转移酶基因asm10,93%的PND-3被转化为AP-3;而在NXJ-22发酵过程中添加SAM合成前体-甲硫氨酸,PND-3产量也有明显降低。除了N-甲基化,喂养试验中DDM的积累也表明3-O-异丁酰化是后修饰阶段的另一限速瓶颈。添加缬氨酸后,胞内isobutyryl-CoA含量明显提升,PND-3和AP-3产量显著提高;而酰基转移酶基因asm19的过表达则对产量无明显影响。这个结果表明,前体供应不足为异丁酰化反应的主要限速因子。随后,通过在asm10过表达突变株NXJ-24发酵过程中,同时添加0.5 mM甲硫氨酸和40 mM缬氨酸,中间产物PND-3消失,后修饰限速因子被成功消除,同时AP-3产量提高到246±6 mg/L,为出发菌株的5倍。此外,本研究也对聚酮链延伸阶段进行了优化。AHBA喂养实验表明,AHBA合成在野生型中可能并非限速因子,而聚酮链延伸阶段则可能存在瓶颈。基于基因组和转录组数据分析,对PKS基因ansa9/ansa10进行过表达,使AP-3产量相比野生型菌株提高了1.3倍。另一方面,通过过表达C2和C3延伸单元合成相关基因acc(乙酰辅酶A羧化酶基因)与mcm(甲基丙二酰辅酶A变位酶基因),或消除竞争性PKS基因簇,使得AP-3产量分别提高了28%、45%和12%。这意味着聚酮合酶表达不足和延伸单元供应不足都限制了聚酮链延伸效率。本研究通过中间产物定向喂养策略,首次鉴定了AP-3生物合成后修饰阶段的限制因子,并利用限速酶基因过表达及前体添加策略,解除了这些限速步骤,大幅度提高了AP-3产量。同时,通过提高聚酮合酶表达水平和增强延伸单元供应,优化了AP-3的聚酮链延伸过程。本研究为天然产物生物合成瓶颈的鉴定及聚酮类化合物的高产研究提供了借鉴。