急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS),包括急性心肌梗死及不稳定性心绞痛,是一类致死、致残率极高的急性心血管事件,大多数ACS的发生由动脉粥样易损斑块(不稳定斑块)突然破裂并继发急性血栓所致。动脉粥样斑块的不稳定性与多种因素有关,包括大的脂质核心、巨噬细胞的大量浸润、纤维帽变薄、内皮功能严重不良、斑块中平滑肌及蛋白聚糖基增多、斑块表面血小板聚集、斑块内出血等,其中斑块的纤维帽变薄是导致斑块在高血流状态或其他刺激状态下突然破裂的重要因素之一。纤维帽的主要成分是细胞外基质(extracellular matrix,ECM),而基质金属蛋白酶(extracellular matrix metalloproteinase,MMPs)可以分解细胞外基质,从而导致纤维帽因主要成分降解而发生斑块破裂。CD147,又名细胞外基质金属蛋白酶诱导剂(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN),可以诱导多种细胞(包括单核细胞、平滑肌细胞等)分泌MMPs,MMPs可降解斑块纤维帽主要成分细胞外基质,加速斑块不稳定,引发急性心血管事件。CD147最早发现于肿瘤细胞,但广泛存在于多种细胞中,包括单核细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、淋巴细胞、粒细胞等多种细胞中。最近的研究发现,CD147作为一种新型受体存在于血小板的a颗粒及血小板的开放管道系统(open canalicular system,OCS),在血小板被激活剂刺激时释放到血小板表面,而表达于血小板表面的CD147,第一,可以反过来促进血小板的活化,第二,可以诱导单核细胞分泌基质金属蛋白酶-9(MMP-9),而MMP-9是可以导致细胞外基质分解的很强的分解酶。第三,由CD147诱导多种细胞产生的膜型基质金属蛋白酶-1(membrane type1matrix metalloproteinase, MT1-MMP)可以在CD147的作用下促进单核细胞、平滑肌细胞摄取氧化性低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL,低密度脂蛋白被氧化后),加快泡沫细胞的生成,从而加速动脉粥样硬化进程。第四,CD147还可以促进血小板与单核细胞的相互作用,促进单核细胞向血管壁迁移,加快动脉粥样硬化的进程。有研究发现,循环血液血小板上CD147的表达与冠心病(Coronary Heart Disease, CHD)成正相关,与正常人相比,冠心病病人的血小板上CD147的表达明显增高,并且循环血小板CD147的表达也与年龄相关,老年人的血小板CD147表达较高。Ox-LDL通过启动泡沫细胞的形成、直接损害血管内皮细胞使血管内皮功能受损、促使多种炎性介质的分泌而参与动脉粥样硬化的发生和进程。Ox-LDL是低密度脂蛋白被氧化后的产物,在正常人的血液中含量极低,而在动脉粥样硬化患者或者冠心病患者体内明显升高,在斑块部位更高。研究表明,血液中ox-LDL水平的高低与急性冠脉综合征的严重程度也密切相关。动脉粥样硬化患者体内存在的ox-LDL可以与血小板发生作用,有研究表明急性冠脉综合征的病人体内ox-LDL与血小板的结合体明显增高。Ox-LDL是血小板独立的激活剂,可以促进血小板聚集,甚至颗粒释放。尽管也有学者认为低浓度的ox-LDL抑制了血小板的活化,但是ox-LDL通过与血小板上CD36, LOX-1、SR-A等多种受体结合而激活血小板已广泛被接受。Ox-LDL可以诱导冠状动脉平滑肌细胞、单核细胞分泌CD147,然而ox-LDL是否可以诱导血小板CD147的表达目前尚不清楚,血小板的活化在急性冠脉综合征的发生中起重要作用,ox-LDL与急性冠脉综合征的严重程度密切相关,CD147又是促进斑块不稳定的重要物质,ox-LDL是不是会通过诱导血小板上调CD147从而加速斑块不稳定目前尚不清楚。高密度脂蛋白(High low-density lipoprotein,HDL)可以通过逆向转运胆固醇(reverse cholesterol transport,RCT)、保护内皮功能、抗炎抗氧化等多种途径对血管起保护作用。此外,HDL可以通过与血小板上清道夫受体B族I(SR-BI)结合从而抑制血小板的活化。然而,HDL对于血小板CD147的表达是否也有抑制作用目前尚不清楚。本实验在体外,以ox-LDL、HDL对血小板直接干预,采血流式细胞仪、ELISA、共聚焦显微镜、透射电镜等手段研究发现,ox-LDL上调了血小板CD147表达,而HDL抑制了ox-LDL诱导的血小板CD147上调。[材料与方法]1、实验对象以本院健康志愿者新鲜静脉血来提取血小板。供血者入选条件：(1)无高血压、糖尿病、肾病、心脑血管疾病、血液病、肝病及传染病；(2)不吸烟；(3)近2周内未服用任何药物；(4)24小时内未曾饮酒；(5)前臂静脉暴露明显或较粗(前臂静脉主要指肘前静脉、或头静脉,若纤细,由于采用较粗针头不易采血顺利)；(6)至少空腹12小时。2、实验方法2.1提取血小板2.1.1采集静脉血室温在22℃-24℃下,由经培训的采血护士采血,选肘中静脉,以21G蝶形针头穿刺,用2支20mL注射器匀速抽拉采血共28mL,分别弃前2mL血后立即注入盛有抗凝剂ACD-A(2.5%柠檬酸盐,1.4%柠檬酸,2%葡萄糖)的离心管中,抗凝剂与全血体积比为1：6。立即轻柔混匀。2.1.2制备洗涤血小板主要步骤：(1)、获得富含血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP):将离心机预温至24℃,以100xg相对离心力离心15分钟,以粗口一次性吸管小心吸取离心后的上清液,置于另一洁净无菌离心管中；(2)、洗涤：将PGE1加入到PRP,37℃恒温箱孵育10分钟后,配平两离心管,于24℃(离心机设定温度),500x g相对离心力离心8分钟后,取出,以吸管弃去上清液,用改良台式液以最轻柔的方式将沉于离心管底的血小板悬起；(3)、再洗涤：将(2)中血小板悬液加入PGE1(1μM)孵育后按(2)进行,共洗涤2次。2.1.3血小板鉴定2.1.3.1光镜下观察血小板形态主要步骤包括：(1)、全血涂片瑞氏-姬姆萨染色后油镜下观察血小板是否活化(形态改变)；(2)、将PRP涂片瑞氏-姬姆萨染色,油镜下观察血小板的形态及是否有杂细胞；(3)、洗涤血小板涂片及盖片光镜下观察。2.1.3.2流式细胞仪检测主要步骤包括：(1)、CD61-FITC与SSLOG圈定血小板,观察是否有杂细胞,是否血小板形态离散；(2)、检测圈定血小板的CD62P表达率,检测人为活化程度；(3)、以凝血酶刺激洗涤血小板检测血小板活化功能。2.2流式检测血小板CD147、CD62P、CD632.2.1ox-LDL刺激分别以50μg/ml(低浓度组)、100μg/ml ox-LDL(高浓度组)两种浓度的ox-LDL于37℃水浴箱孵育25分钟,孵育后均加入抗人CD61-FITC抗体以圈定血小板群,两种浓度的ox-LDL处理组均分别加入CD62P、CD63、CD147的抗体,暗箱孵育20分钟后加入台氏液500μl,立即上机检测。对照组加入等体积PBS。各组均设同型对照,以各抗体的阳性细胞百分率及CD147相对平均荧光强度为分析指标。2.2.2加入HDL在另一平行组,加入50μg/ml、100μg/ml ox-LDL两种浓度的ox-LDL之前的血小板预先加入HDL(100μg/ml)37℃水浴箱孵育10分钟后分别加入50μg/ml、 ox-LDL,37℃水浴箱孵育25分钟后分别加入抗体,孵育后上机检测。各组均设同型对照,以各抗体的阳性细胞百分率及CD147相对平均荧光强度为分析指标。对照组加入等体积PBS。定义相对平均荧光强度为某单克隆抗体的平均荧光强度与其对应同型抗体的平均荧光强度之比。2.3ox-LDL处理血小板后可溶性CD147(sCD147)的检测以50μg/ml、100μg/ml ox-LDL干预25分钟后的洗涤血小板与对照组(加入PBS的血小板)在24℃环境相对离心力750xg下离心20分钟,小心收集上清液于洁净EP管中,按人可溶CD147ELISA检测说明书操作。2.4共聚焦显微镜(LSM)观察ox-LDL对血小板形态的影响将以50μg/ml、100μg/ml ox-LDL处理(37℃孵育25分钟)洗涤血小板与对照组血小板同时加入抗人CD61-FITC抗体(5μl/100μl样品)后以吸管及硅化玻片涂抹于硅化玻片,加盖玻片后立即LSM下观察。2.5透射电子显微镜(TEM)观察血小板观察四组：50μg/ml、100μg/ml ox-LDL处理组、对照组、HDL+50μg/ml处理组主要步骤：(1)用2%的多聚甲醛+2.5%的戊二醛固定洗涤血小板；(2)新饿酸固定前固定血小板样品；(3)洗涤；(4)逐级酒精脱水(5)包埋、切片(6)醋酸双氧铀,柠檬酸铅染色(7)上机镜检。3、统计学处理以上实验均重复至少5次,所有数据均以x±s表示,不同浓度ox-LDL处理的血小板(对照组、50、100μg/ml ox-LDL)的CD62P、CD63、CD147表达以One-Way ANOVA分析,组间多重比较采用LSD-t检验(或Dunnett’s T3法)行两两比较；同等浓度ox-LDL处理的有或无HDL孵育组以配对t检验分析。采用SPSS13.0分析软件分析,以P<0.05为差异有统计学意义[结果]1、Ox-LDL上调了血小板CD147表达50μg/ml、100μg/ml ox-LDL处理后的洗涤血小板CD147阳性细胞表达率分别为8.06±3.90%,10.70±3.33%,均明显高于对照组为0.58±0.31%(P=0.032,0.006),而50μg/ml、100μg/ml ox-LDL两处理组间未见统计学差异(／>0.05)低、高ox-LDL处理组CD147相对平均荧光强度均高于对照组(P<0.001)。ELISA检测经ox-LDL刺激后的可溶性CD147表达可见,高ox-LDL处理组与低ox-LDL处理组未见明显差异(P=0.272),但高于对照组(P=0.048),低ox-LDL处理组与对照组无统计学差异(P=0.243)。TEM观察到,经ox-LDL处理后,血小板发生了脱颗粒,包括α颗粒的释放。2、Ox-LDL促进了血小板CD62P、CD63的表达50、100ng/ml ox-LDL干预后的洗涤血小板表达CD62P均高于对照组(P<0.001,P=0.004),而两处理组间未见统计学差异,ox-LDL也同样增加了CD63表达。CD62P、CD63分别存在于血小板的a颗粒、溶酶体颗粒中,通过TEM观察也可间接反映ox-LDL促进了其释放。3、HDL抑制了ox-LDL诱导的血小板CD147、CD62P、CD63的表达预先以HDI(100μg/ml)孵育洗涤血小板后再分别以ox-LDL(50μg/ml,100μg/ml)处理,流式细胞仪检测发现,HDL+50μg/ml ox-LDL组与HDL+100μg/ml ox-LDL组较其对应组表达CD147均有下降(P=0.027,P=0.017), HDL也表现出抑制了ox-LDL刺激的血小板CD62P与CD63表达(P均小于0.05)。[结论]本研究表明,体外ox-LDL上调了血小板CD147表达,同时也促进了CD62P、 CD63表达,同时HDL抑制了ox-LDL诱导的血小板CD147、CD62P、CD63表达。本研究可能开启关于ox-LDL促使动脉粥样斑块不稳定的一种新的视角,也揭示了HDL在动脉粥样斑块稳定性起保护作用的可能机制。