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原发性肝癌是当今社会人类癌症死亡的第三大原因,也是我国最常见的恶性肿瘤之一,死亡率仅次于胃癌和食道癌。其中,肝细胞癌(HCC,Hepatocellular Carcinoma)约占原发性肝癌的90%。HCC由于其发病隐匿,生存周期短,预后差,死亡率高而成为目前研究的热点领域之一。尽管分子靶向药物增加了HCC患者的生存周期,但HCC治疗仍面临着巨大挑战。现有研究认为,HCC发生发展关联到多种信号通路失调,其中包括TGF-b/Smad,它直接或间接地与micro RNAs相互作用并在癌变过程中担任着重要角色。研究认为,micro RNA-21在HCC中表达上调,而micro RNA-145在HCC中表达下调,但是它们的异常表达是如何与TGF-b/Smad信号通路下游Smad3蛋白特定结合域磷酸化相互关联,还是未知的。本研究在此基础上,探究Smad3C末端(p Smad3C)和连接区磷酸化(p Smad3L)与micro RNA-21和micro RNA-145在HCC中的相互作用以及对HCC进展影响的作用机制。目的:1.建立裸鼠移植瘤模型,采用agomir/antagomir分别在裸鼠移植瘤中干预mi R-21和mi R-145的表达,观察分别下调micro RNA-21和上调micro RNA-145对肿瘤生长及肿瘤细胞凋亡的影响。2.分别将选择性上调p Smad3C或p Smad3L蛋白水平的稳转细胞株(Smad3EPSM,Smad3 3S-A)接种到裸鼠体内,建立肝细胞癌移植瘤模型,观察分别上调p Smad3C和p Smad3L蛋白水平对肿瘤生长和肿瘤细胞凋亡的影响。3.在肝细胞癌移植瘤模型中,检测下调micro RNA-21表达或上调micro RNA-145表达对p Smad3C和p Smad3L蛋白水平的影响;4.在分别选择性上调p Smad3C和p Smad3L蛋白水平的裸鼠移植瘤模型中检测micro RNA-21和micro RNA-145表达。5.探究在HCC中micro RNA-21/145和p Smad3C/3L的相互作用以及对HCC进展的影响。方法:1.整体动物实验:实验一:雄性BALB/c裸鼠24只,3-5周龄,14-18g,适应性饲养一周。选取状态良好,对数生长期的Hep G2细胞,调细胞密度至4.5×107细胞/ml,每只裸鼠接种0.2ml,每只裸鼠接种细胞数量9×106。分别向各组裸鼠皮下接种Hep G2细胞,待皮下形成明显瘤块后,按瘤体积均分为4组(n=6):mi R-21 antagomir NC组,mi R-21 antagomir组,mi R-145 agomir NC组和mi R-145 agomir组。分别向瘤体内注射20ml mi R-21antagomir NC,mi R-21 antagomir,mi R-145 agomir NC和mi R-145 agomir,每4天注射1次,注射7次后取材。28天后,处死动物,取出瘤块,排水法测量瘤体积,Western-blot和免疫组织化学方法检测瘤体中p Smad3C、p Smad3L和Smad3、Smad4的表达情况,HE染色检测细胞病理学改变,透射电镜检测细胞凋亡情况。雄性BALB/c裸鼠24只,3-5周龄,14-18g,适应性饲养一周。随机分为四组(n=6):Hep G2组,WT组,EPSM组和3S-A组。分别向裸鼠皮下接种稳转Hep G2细胞的Smad3 WT,Smad3 EPSM和Smad3 3S-A细胞(细胞数9×106),待皮下形成明显瘤块后,每4天1次测量肿瘤体积。28天后,处死动物,取出皮下瘤块,测量瘤重瘤体积。Western-blot法检测瘤组织中p Smad3C,p Smad3L和Smad3蛋白表达情况;HE染色和透射电镜检测细胞凋亡情况;q RT-PCR法检测各组中micro RNA-21/145的表达情况。2.体外细胞实验:体外常规培养HepG2细胞,传代培养,选取生长状态良好,对数生长期的细胞,待培养瓶中细胞长至单层铺展面积达90%-95%时,弃培养液,每瓶加胰酶消化(1 ml,17℃,2 min),加DMEM混悬细胞(1.5 ml),转移至10 ml管中(四瓶细胞),离心沉淀细胞(低速离心机,1500转,5 min),弃上清,加PBS混悬细胞。调细胞密度至4.5×107细胞/ml,每只裸鼠接种0.2 ml,每只裸鼠接种细胞数量9×106。向Hep G2细胞中转染mi R-21 antagomir/NC和mi R-145 agomir/NC,体外检测p Smad3C/3L表达。体外培养Hep G2细胞,使用脂质体稳定转染法将三种质粒Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A转入Hep G2细胞中,经G418(600?g/ml)筛选,获得稳定表达转染质粒特性的三种稳转细胞株(Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad33S-A)。q RT-PCR检测各细胞中micr RNA-21/145表达情况。结果:1.下调的micro RNA-21和上调的micro RNA-145表达分别抑制HCC肿瘤体积生长并促进肿瘤细胞凋亡肿瘤负荷和肿瘤细胞存活是癌症的两个重要的标志性表型,并且它们与失调的TGF-?信号传导有关。使用免疫缺陷动物(包括BALB/c裸鼠)可以实现肿瘤细胞异种移植。这种肿瘤模型可以用于研究癌症表型以及潜在的失调的细胞信号转导机制。为了研究mi R-21和mi R-145在HCC肿瘤生长和肿瘤细胞凋亡中的作用,我们采用了向建立的HCC移植瘤模型中注射mi R-21 antagomir和mi R-145agomir的方法来干预mi R-21和mi R-145表达。与mi R-21 antagomir NC组相比,mi R-21 antagomir组肿瘤体积减小;与mi R-145 agomir NC相比,mi R-145 agomir组肿瘤体积显著减小(P<0.01);肿瘤细胞形态上,与对照组相比,mi R-21antagomir组和mi R-145 agomir组可见明显的细胞核皱缩,颜色加深;透射电镜检测细胞凋亡情况,可见mi R-21 antagomir组和mi R-145 agomir组肿瘤细胞凋亡程度明显增加。2.HCC中,分别下调micro RNA-21和上调micro RNA-145表达对p Smad3C/3L表达的影响鉴于已有研究表明,MAPK和TβRI分别对Smad3C和Smad3L磷酸化发挥重要作用,我们想要进一步研究这种作用是否与mi R-21和mi R-145表达有关。然而,与NC组相比,mi R-21 antagomir组p Smad3C/3L表达没有明显变化;但是与mi R-145 agomir NC组相比,mi R-145 agomir组p Smad3C蛋白水平明显上调(P<0.01)而p Smad3L蛋白水平则显著降低(P<0.01)。3.在HCC中分别特定高表达p Smad3C/3L对micro RNA-21和micro RNA-145表达的影响分别向Hep G2细胞中转染Smad3 WT,Smad3 EPSM,Smad3 3S-A,获得稳定表达质粒特性的稳转细胞株。分别向裸鼠皮下接种三种稳转细胞,由结果可知,与WT组相比,EPSM组裸鼠肿瘤体积明显减小(P<0.01),相反,3S-A组肿瘤体积显著增加(P<0.01)。与瘤体积变化一致的是,EPSM组p Smad3L蛋白水平显著增高而3S-A组p Smad3L蛋白水平则明显增加,p Smad3C蛋白水平情况则与p Smad3L相反。细胞形态上,WT组肿瘤细胞大小不一、形态变异大、排列疏松,核大而不规则、核分裂象多;EPSM组瘤块细胞大小接近正常、形态较为规则、呈索梁状排列,核圆较为规则、核分裂象较少;3S-A组瘤块细胞大而不规则、排列松散紊乱,核大而深染、核分裂象多。电镜检测显示,WT组肿瘤细胞生长旺盛,胞浆中可见大量线粒体分布,细胞核大而染色质密集;EPSM组肿瘤细胞大小适中、细胞核稍有固缩、核仁较小;3S-A组肿瘤细胞中可见大量线粒体及发达的内质网结构,细胞核异形明显,分裂象多。q RT-PCR结果显示,与WT组相比,EPSM组瘤块中mi R-145表达显著升高(P<0.01)而mi R-21表达明显降低(P<0.01),3S-A组瘤块中mi R-145表达显著降低(P<0.01)而mi R-21表达明显降低(P<0.01)。结论1.在HCC中下调mi R-21表达或上调mi R-145表达抑制肿瘤体积生长并促进肿瘤细胞凋亡。2.在HCC中上调mi R-145表达显著升高pSmad3C而降低pSmad3L。HCC中mi R-145可以促进肿瘤促进信号p Smad3L向抑癌信号p Smad3C的转换。3.在HCC中pSmad3C蛋白水平增高抑制肿瘤体积生长并促进肿瘤细胞凋亡;而p Smad3L蛋白水平增高则促进肿瘤生长并抑制肿瘤细胞凋亡。4.在HCC中p Smad3C表达增高引起mi R-21表达降低而mi R-145表达升高;而p Smad3L表达增加则引起mi R-21表达升高而mi R-145表达升高。5.在HCC中mi R-21/145与p Smad3C/3L存在交互作用且共同影响肿瘤进程。