研究背景四氯苯醌（tetrachloro-p-benzoquinone,TCBQ）是一个全卤代醌类化合物,可被用作电子受体,并且它是曾广泛使用的杀真菌剂六氯苯（hexachlorobenzene,HCB）和五氯酚（pentachlorophenol,PCP）主要的中间代谢产物。由于HCB和PCB的结构稳定且在我们周围环境中广泛存在,其对人类健康仍然构成威胁。一些研究表明,环境污染物HCB和PCP的生物毒性可能是由其氧化代谢产物TCBQ引起的。另外,TCBQ本身也被广泛用作杀菌剂,颜料生产过程中的化学试剂和化学工业中的电子受体。TCBQ的同系物也被确定为饮用水消毒副产物。因此,全面了解细胞对TCBQ的反应机制是改善TCBQ毒性治疗方案或减少细胞损伤的关键。神经退行性疾病是一大类神经疾病的统称,也称为错误折叠蛋白疾病,与错误折叠的蛋白斑块积聚有关。神经退行性疾病的发病机制复杂,包括氧化应激和内质网应激。最新的数据显示,铁死亡也参与神经退行性疾病的发病进程。体内外研究已经证明TCBQ可以引起氧化应激,内质网应激,炎症和基因毒性。最近,我们发现TCBQ可以激活凋亡信号通路进而导致神经毒性。然而,TCBQ诱导神经毒性的分子机制还未研究清楚。研究目的全面了解细胞对TCBQ反应的机制对于减少其毒性至关重要。本研究以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（PC12细胞）作为神经细胞模型,研究TCBQ诱导PC12细胞神经毒性的分子机制,以及细胞对TCBQ神经毒性的抵抗机制,为预防和治疗TCBQ的神经毒性提供理论依据。方法和结果（1）TCBQ对PC12细胞内质网应激的影响。首先,我们考察内质网应激的标志蛋白GRP78和内质网腔在TCBQ的作用下是否发生改变,Western blot结果表明TCBQ增加GRP78的表达。在透射电镜下观察到给药后PC12细胞的内质网腔发生明显的扩张,这是内质网应激的典型特征。随后,我们检查了内质网应激导致的非折叠蛋白信号通路中三个分支的激活状态。Western blot结果显示TCBQ能够激活PERK-eIF2α-ATF4-CHOP信号通路,而内质网应激特异性抑制剂4-PBA可以显著抑制TCBQ诱导的GRP78,p-PERK和p-eIF2α的表达。接着,我们检查了TCBQ对IRE1α信号通路的影响。Western blot实验表明TCBQ可以上调IRE1α的磷酸化,但对JNK的活化和c-Jun的表达没有影响。鉴于XBP-1在内质网应激信号通路中的重要作用,我们接下来检测TCBQ对XBP-1 mRNA切割的影响。RT-PCR和RT-qPCR结果显示TCBQ可以促进XBP-1 mRNA剪接体的表达,表明TCBQ对XBP-1信号通路的激活。接下来,我们发现TCBQ对ATF6信号通路没有影响。最后,我们还研究了TCBQ对细胞内Ca²+平衡的影响,结果表明,TCBQ上调了细胞内游离钙浓度[Ca²⁺]_i,打破了Ca²⁺平衡,进而激活了Caspase 12。因此,我们阐明了TCBQ诱导PC12细胞内质网应激的分子机制。（2）TCBQ通过内质网应激激活死亡受体5信号通路诱导PC12细胞凋亡。这部分结果表明,TCBQ诱导的内质网应激可通过上调死亡受体5（death receptor 5,DR5）的表达,导致PC12细胞中促凋亡信号的激活。首先,免疫荧光双染和免疫共沉淀实验显示TCBQ影响DR5在细胞中的转运和分布。TCBQ通过上调DR5的表达并增强细胞膜上死亡诱导信号复合体（death-inducing signaling complex,DISC）的形成诱导PC12细胞凋亡。与对照siRNA组相比,DR5 siRNA部分逆转了TCBQ诱导的Caspase 8、Caspase 3和PARP-1的活化。RT-qPCR结果显示放线菌素D（ActD）完全阻断了TCBQ诱导的DR5 mRNA的表达,并且加入放线菌酮（CHX）也减少了由TCBQ诱导的DR5 mRNA的增加,说明增强DR5 mRNA的表达需要转录激活和转录因子的从新合成。由于CHOP是DR5的转录因子,为了阐明ATF4-ATF3-CHOP信号通路在DR5诱导细胞凋亡中的作用,我们分别用ATF4,ATF3或CHOP的siRNA转染细胞,结果表明ATF4-ATF3-CHOP途径参与TCBQ对DR5表达的调控。上述结果显示TCBQ可以诱导PC12细胞发生内质网应激,并可通过其下游的ATF4-ATF3-CHOP信号轴调控DR5基因的转录,进而诱导细胞凋亡。最后,N-乙酰半胱氨酸（NAC）的加入缓解了TCBQ诱导的氧化应激、内质网应激和DR5的表达,表明TCBQ诱导的细胞凋亡和内质网应激是由ROS介导的。（3）TCBQ通过内质网应激改变蛋白质二硫键异构酶的亚细胞分布进而诱导PC12细胞凋亡。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase family proteins,PDIs）可以调节各种神经退行性疾病的发病进程,包括帕金森病和阿尔茨海默病。我们假设PDIs的亚细胞易位涉及在TCBQ介导的生存/死亡信号转换中。有趣的是,PC12细胞暴露于TCBQ后,PDIA1/PDIA3的抑制剂（或siRNA）加重了低浓度（10μM）TCBQ诱导的细胞死亡。然而,抑制PDIA1/PDIA3却减弱了高浓度（20μM）TCBQ的毒性。针对这一现象,我们进一步探索PDIs作为多效凋亡调节开关调控TCBQ毒性的机制。Western blot和生物素转换实验表明TCBQ对PDIs的蛋白表达和S-亚硝基化修饰无任何影响,表明TCBQ可能不影响PDIs的活性。亚细胞组份分离和免疫荧光双染实验揭示了TCBQ处理后PDIs蛋白会从内质网腔释放到细胞质中。接着我们研究了细胞质中PDIs对线粒体外膜通透化（mitochondrial outer membrane permeabilization,MOMP）的影响。实验结果显示PDIs促进了TCBQ诱导的细胞色素c的释放和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）的下降,表明PDIs在TCBQ介导的MOMP中发挥重要的作用。接下来,我们调查了PDIs调控MOMP的分子机制,线粒体交联实验证实Bak在线粒体膜上的寡聚化与TCBQ介导的MOMP同时发生,进一步研究发现PDIA1和PDIA3可能通过触发Bak而不是Bax在线粒体膜上寡聚化,进而诱导MOMP。我们用NAC和4-PBA分别做为ROS和内质网应激的抑制剂,Western blot实验结果表明NAC和4-PBA均可阻止PDIs泄露到细胞质中,TUNEL、CCK-8和LDH实验结果显示NAC抑制TCBQ诱导的细胞死亡。这些结果表明ROS的形成是TCBQ诱导PDIs从内质网中释放和细胞凋亡的前提。（4）Nrf2信号通路的激活减弱TCBQ诱导内质网应激的分子机制。在上述实验中,虽然已经研究了TCBQ诱导内质网应激依赖的细胞凋亡机制,但是TCBQ是否引起细胞防御系统的开启尚不清楚。在这里,我们发现核转录因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2）可以通过上调PC12细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）水平引发细胞的适应性反应,降低TCBQ的神经毒性。TCBQ主要通过以下两种方式调控GSH水平:（i）激活Nrf2可诱导SLC7A11（也称为xCT）的表达,促进胱氨酸进入细胞,胱氨酸在细胞内能迅速转化为半胱氨酸（GSH合成的前体）;（ii）激活Nrf2可导致GSH合成限速酶GCL表达的上调,GCL由GCLM和GCLC两个亚基组成。GSH有助于维持细胞抗氧化能力和蛋白质巯基稳态,特别是在内质网中,GSH的这些功能尤为重要。因此,GSH具有抑制内质网应激和促进细胞存活的能力。敲除Nrf2或用BSO消耗细胞内的GSH加剧了TCBQ诱导的内质网蛋白巯基的损伤。相反,用NAC增加GSH水平后减弱了TCBQ诱导的蛋白质损伤、内质网应激程度和细胞死亡。这些现象表明,GSH受到抑制的细胞易受TCBQ诱导的内质网应激和细胞凋亡的影响。总体而言,我们的研究分析了Nrf2和内质网应激与TCBQ神经毒性之间的关系,并且表明Nrf2的激活可通过调节GSH的合成进而维持蛋白质巯基稳态来帮助PC12细胞抵御TCBQ诱导的内质网应激和细胞死亡。（5）探讨铁死亡在TCBQ诱导神经毒性中的作用机制,揭示Nrf2在铁死亡发生过程中的作用。我们首先证实一种新的程序性死亡机制-铁死亡（Ferroptosis）可以在PC12细胞中存在。接着,我们检测铁死亡是否参与了TCBQ的神经毒性。Fer-1是铁死亡特异性抑制剂,DFP是铁离子特异性螯合剂。Fer-1和DFP处理细胞后可削弱TCBQ诱导细胞死亡的能力。相反,给细胞额外的铁离子增强了TCBQ诱导细胞死亡的能力。通过透射电子显微镜,我们观察到在TCBQ处理下有部分细胞的线粒体皱缩并且线粒体电子云密度增加,这些是铁死亡特有的细胞形态学改变。上述结果表明TCBQ可诱导PC12细胞发生铁死亡。接着我们进一步研究了TCBQ诱导铁死亡的分子机制和涉及到的信号通路。p53、铁自噬、NOX2和JNK信号通路不参与TCBQ对铁死亡的调控,而TCBQ诱导的铁死亡可能是依赖于PKCα和VDAC2/3信号通路的激活。铁离子超载和脂质过氧化越来越被认为是铁死亡的重要诱因。因此,我们首先检测TCBQ诱导的铁死亡是否通过增加细胞中游离铁的水平来促进ROS积聚。Western blot结果表明TCBQ增加了转铁蛋白受体1（TFRC）和转铁蛋白（TF）的表达,促进铁离子进入细胞。令人惊讶的是,我们发现TCBQ可通过上调储铁蛋白重链（FTH1）的表达,提高储铁能力,从而降低细胞内的铁离子浓度。与此结果一致,我们通过检测细胞内铁离子浓度发现尽管TCBQ最初引起细胞内游离铁水平的增加,但是随着Nrf2的激活,细胞内铁离子的水平逐渐恢复。同时,我们的实验结果发现TCBQ导致PC12细胞发生铁死亡的程度较低,这有可能是因为TCBQ激活了铁死亡负调控因子Nrf2造成的。此外,GPX4的缺失或GSH的降低可以通过诱导脂质过氧化进而引发铁死亡。尽管我们发现TCBQ可以降低PC12细胞中GPX4的表达,但随着GSH的上调,GPX4的活性逐渐恢复。另外,BSO加剧了TCBQ诱导的脂质过氧化产物的生成和细胞死亡。且Nrf2的敲低增强了TCBQ产生ROS的能力并增加了细胞内游离铁离子的浓度。这些研究结果表明,TCBQ可以诱导细胞内铁离子超载和脂质过氧化物的生成,而Nrf2的激活通过调控铁代谢和GPX4的活性来帮助PC12细胞抵御TCBQ诱导的铁死亡。研究结论（1）TCBQ能够诱导PC12细胞内质网应激并激活下游主要的信号通路。TCBQ可以诱导PERK/eIF2α,XBP-1和Caspase 12信号通路的活化,但对ATF6和JNK信号通路无影响。（2）TCBQ可通过ATF4-ATF3-CHOP信号轴诱导DR5的表达,从而增强DISC的形成,继而激活Caspase级联反应,诱导PC12细胞凋亡。NAC可以抑制TCBQ对DR5的调控,表明TCBQ的神经毒性与其产生的ROS有关。（3）持续的内质网应激会使PDIA1/PDIA3从内质网腔中释放,进而诱导Bak依赖的MOMP,使内质网应激信号从促存活的功能转变成促进细胞凋亡。而ROS的形成是TCBQ诱导PDIs从内质网腔释放的原因。总的来说,PDIs的亚细胞定位决定PC12细胞面对TCBQ的“活或死”命运。（4）TCBQ可以激活Nrf2这一细胞防御系统,进而通过上调GCL亚基和SLC7A11的表达来增强GSH的合成。我们证实了PC12细胞可通过GSH增强内质网蛋白抵抗TCBQ损伤的能力。这些发现帮助我们了解TCBQ引发的细胞应答反应,表明Nrf2可作为治疗和预防TCBQ毒性的靶点。（5）TCBQ可以在PC12细胞中诱导铁死亡的发生。TCBQ对p53,铁自噬,NOX2和JNK信号通路无影响,而PKCα和VDAC2/3信号通路可能参与TCBQ诱导铁死亡的过程。值得注意的是,Nrf2的激活可增强细胞的储铁能力和降低脂质过氧化物的产生,促使PC12细胞抵抗铁死亡。