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目的:以人成骨肉瘤细胞MG-63为研究对象,探讨斑蝥酸钠维生素B6注射液诱导人成骨肉瘤细胞株MG-63细胞凋亡的作用及其分子机制,为骨肉瘤的治疗提供实验基础。方法:将人骨肉瘤细胞株MG-63细胞于37℃,5%CO2培养箱内按常规条件进行传代培养,待细胞进入对数生长期后用胰蛋白酶消化成单细胞悬液后进行操作。采用以下实验:1采用四唑盐(MTT)比色法检测细胞增殖,将骨肉瘤细胞接种于96孔培养板上,贴壁后分别加入不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6注射液,置于培养箱培养24、48、72小时后分别加入MTT10微升,孵育4小时,弃上清液加入DMSO振荡5min使结晶物充分溶解,在酶联免疫检测分析仪上测定OD492的值,根据公式计算抑制率。2形态学观察细胞接种贴壁后分别加入不同浓度的药物后分别培养24、48、72小时后在倒置显微镜下观察细胞形态改变并照相。3流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡、细胞周期分布:收集不同浓度斑蝥酸钠维生素B6注射液处理24小时后培养细胞的MG-63及对照组细胞,冷PBS漂洗。预冷70%乙醇4℃,固定,上机检测前离心去固定夜,0.5%胃蛋白酶消化,碘化丙锭室温避光染色,流式细胞仪上机检测,应用软件进行分析。4透射电子显微镜观察:取经不同浓度药物处理24小时的细胞,用体积分数为2.5%戊二醛4℃固定,用10 g/L锇酸后固定,丙酮系列脱水,最后用Epon812环氧树脂包埋,超薄切片机切片,醋酸铀与柠檬酸铅双重染色,电镜下观察细胞超微结构并拍照。5反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Survivin mRNA的表达:实验组和对照组细胞进行培养,收集细胞,提取细胞总RNA。采用一步法进行反转录和扩增。将RT-PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳后,应用凝胶成像系统及凝胶分析软件对电泳条带进行成像分析,用Survivin吸光度与β-actin吸光度的比值代表Survivin的相对含量。结果: 1用不同浓度的斑蝥酸钠维生素B6注射液作用于MG-63细胞后结果显示斑蝥酸钠维生素B6注射液能明显抑制细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。抑制率最高可达到(68.56±5.21)%。2倒置显微镜下观察对照组细胞呈贴壁生长,生长状态良好,细胞透明,呈长梭形,颗粒较少,细胞间界限清楚,细胞核隐约可见。经斑蝥酸钠维生素B6注射液处理组细胞,随斑蝥酸钠维生素B6注射液浓度的增加和作用时间的延长,细胞逐渐变圆,呈漂浮状态生长的细胞数量明显增加,细胞内部结构受到破坏,存活细胞显著减少,至5.0μg/ml时大部分细胞裂解,可见多量细胞碎片。透视电镜观察可见典型的细胞凋亡形态改变:细胞皱缩,胞膜结构保持完整,胞核固缩,核碎裂,染色质浓缩边集,形成新月形胞核,胞浆空泡化明显,细胞表面有较多浓缩的胞质突起。3经药物处理MG-63细胞24小时后,流式细胞仪分析结果显示,MG-63细胞G0/G1期细胞逐渐增多,S期和G2/M期的细胞逐渐减少。经2.5μg/ml斑蝥酸钠维生素B6注射液作用24h后MG-63细胞G0/G1期细胞由对照组的(51.08±2.42)%升高至(75.46±1.72)%,S期、G2/M期的细胞比例减少。FCM发现经斑蝥酸钠维生素B6注射液处理细胞24h后,凋亡率随药物浓度的增加逐渐增高。对照组和药物浓度为2.5μg/ml时凋亡率分别为(1.09±0.18)%和(9.60±0.65)%,两者有显著性差异(P<0.01)差异,经0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.5μg/ml药物浓度处理MG-63细胞24小时后G0/G1期前出现凋亡峰。RT-PCR结果表明:经0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.5μg/ml的斑蝥酸钠维生素B6注射液处理细胞24h后,随着药物浓度的增加, Survivin mRNA表达逐渐降低。结论:斑蝥酸钠维生素B6注射液能明显抑制MG-63细胞增殖,使细胞周期阻滞在G0/G1期,并进一步诱导其凋亡。其机制可能与抑制Survivin的表达有关。确切机制有待于进一步研究。