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微管是真核生物的主要细胞骨架成分之一,在很多细胞生物活动中起着重要的作用。微管是一个动态的结构,其动态性对细胞分裂、细胞迁移、细胞极性等生命活动至关重要。实时监测微管的动态行为有助于理解微管的调控机制和微管相关的细胞活动过程。但是,关于微管动态性调控的具体分子机制,尤其是微管蛋白亚型和微管蛋白翻译后修饰组成的微管密码对微管动态性的调控机制,仍不甚清楚。基于全内反射荧光显微成像的微管体外重构是精细地研究微管自身动态和微管相关蛋白对微管动态性调控的重要手段。该技术手段需要在微管蛋白上偶联荧光基团,但是,这一过程步骤繁琐且导致大部分微管蛋白丧失了微管聚合活性。因此,如何从有限样本中获得单一亚型或特定翻译后修饰的荧光标记微管蛋白是微管领域内的一大瓶颈,从而限制了利用该技术手段对微管蛋白密码的深入研究。目前基于微管药物的小分子化合物探针对微管动态性有显著影响,限制了其在基于全内反射显微成像的微管体外重构系统中的应用。为了避免对微管动态性的干扰,我们选择亲和力适中的小肽片段作为微管探针的识别单元。本论文开发的小肽荧光探针能特异性标记微管,可以取代微管蛋白偶联荧光基团的方法用于体外微管重构分析,这使得利用小鼠和细胞等有限样本来精确分析微管蛋白密码的调控机制成为可能。首先,选择Ph.D.-12和Ph.D.-7这两个噬菌体多肽文库,利用体外组装的微管和微管蛋白分别作为靶标,通过四轮的噬菌体淘选,获得了一系列特异性结合微管或微管蛋白的小肽序列。选取出现频次最高的小肽作为微管探针的候选识别单元,合成了含有FITC荧光基团的小肽探针,发现此时的小肽探针均不能标记微管。鉴于微管羧基端含有多个带负电荷的谷氨酸,依次在小肽探针上分别添加2、4或6个带正电荷的精氨酸,发现添加了6个精氨酸的小肽探针能够很好地标记微管。此外,还测试了TAMRA、CY3、CY5等不同荧光染料的小肽探针对微管标记的效果,发现除了TAMRA荧光基团的探针成像效果不理想外,FITC、CY3和CY5的小肽探针均能够很好地标记微管。因此,开发的探针具有很好的多面性,可方便地用于体外重构微管的多色成像分析。随后分析了小肽荧光探针的性能,通过激光连续照射和荧光光漂白恢复实验,发现开发的探针与目前常用的微管蛋白偶联荧光基团的方法相比,光稳定性较强。探针加在反应溶液里后可直接迅速地标记微管,不需要微管蛋白偶联荧光基团那样耗时耗力的繁琐过程,这体现了小肽探针具有即加即用型的特点。另外,研究还发现小肽探针标记可被洗掉,然后加入另外颜色的探针来更换微管的标记颜色,而微管蛋白偶联荧光基团的方法无法实现这一点。此外,1μM浓度的小肽探针即可特异性地标记微管且具有良好的信噪比。接着分析了小肽探针对微管动态性的影响。研究发现探针对微管自身的动态性没有显著的干扰。表达纯化了DCX、Kinesin-1、MCAK、ch TOG、EB1等微管相关蛋白,证实了探针不干扰这些微管相关蛋白与微管的结合。此外,小肽探针不会干扰Kinesin-1在微管上的滑动,也不会干扰MCAK、ch TOG、EB1等蛋白对微管动态性的功能调控,这表明小肽探针可以用于微管动态性的调控机制研究。最后,利用小肽探针分析了乙酰化修饰对微管动态性的调控。在HDAC6敲低的He La细胞中提纯了微管蛋白,利用小肽探针精确解析了HDAC6调节的去乙酰化修饰对微管动态性的影响。结果表明,小肽探针可用于有限样本来源的微管蛋白的体外重塑实验,解决了微管蛋白偶联荧光基团的方法需要大量微管蛋白的这一技术瓶颈。此外,我们也尝试开发了基于小肽片段的活细胞微管荧光探针。通过识别活细胞微管小肽片段的筛选,研究发现来自于Tau蛋白的126个氨基酸多肽片段可以标记活细胞内的微管,后续还需对这个多肽进一步的优化,尽量缩小多肽的长度并提高其特异性。综上所述,本论文开发的体外微管小肽探针可应用于体外微管重构研究中。该探针与目前常用的微管蛋白偶联荧光基团的方法相比较,具有抗光漂白性、即加即用、可洗脱及着色等优越特点。该探针可以用于微管自身动态性和微管相关蛋白对微管动态性的调控研究。重要的是,该探针解决了目前微管蛋白偶联荧光基团的方法需要事先制备大量微管蛋白的技术瓶颈,适用于有限样本来源的微管动态性调控研究。本论文的工作为深入理解微管蛋白密码对微管动态性的调控机制和微管相关的细胞活动提供了有力工具。