动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是冠心病的潜在病因之一,75%以上的急性冠脉综合征事件由AS易损斑块引起。炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等均可加剧动脉粥样硬化斑块纤维帽变薄及坏死核心增大的程度,形成易损斑块。近年来研究表明,AS内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖、巨噬细胞凋亡等病理环节与DNA异常甲基化密切相关。DNA甲基化可以独立于DNA序列外影响遗传效应,调控下游基因表达,赋予物种个性化特征,其高甲基化和低甲基化的特点,与中医个体化、阴阳理论不谋而合。因此,有望通过DNA甲基化影响AS发生发展及其相关机制的研究,深入阐述中医药发挥作用的机制。活血解毒是防治动脉粥样硬化的基本治法之一,活血解毒方药可通过抗炎、抑制细胞凋亡、降脂等作用稳定AS易损斑块。栀子川芎具有活血解毒的功效,是导师辨治冠心病瘀毒证的核心药对。栀子川芎对稳定ApoE-/-小鼠易损斑块作用效应如何?栀子川芎能否通过DNA甲基化调控MAPK信号通路进而影响细胞凋亡?这些问题都有待解答。基于此,本课题从药效物质基础、药效学、生物信息学和分子机制层面进行研究,探讨栀子川芎对AS易损斑块的干预效应及其与DNA甲基化和细胞凋亡间的关系。1临床研究基于“瘀毒”理论挖掘徐凤芹教授辨治冠心病的用药规律目的:挖掘徐凤芹教授辨治冠心病瘀毒证的临床用药规律,为后续实验研究提供依据。方法:回顾性分析中国中医科学院西苑医院门诊HIS系统导师治疗冠心病瘀毒证的医案,借助《古今医案云平台V2.3.5》,采用关联规则及复杂网络分析的方法,探索导师基于“瘀毒”理论辨治冠心病的核心药对及处方。结果:本研究共纳入医案211例,涉及中药195味。徐凤芹教授辨治冠心病瘀毒证四气以温、平、寒并进;五味辛、苦、甘并重;功效以燥湿化痰、祛风止痛、活血祛瘀为主。舌质以暗红为主,脉象以弦为首。用药规律方面,川芎、栀子是应用频率最高的单味活血、解毒中药;高频药对有赤芍-川芎、赤芍-丹参、炙黄芪-丹参、桅子-川芎、炙黄芪-党参等;复杂网络分析核心处方包括川芎、栀子、法半夏、丹参、赤芍、炙黄芪、党参、陈皮、郁金共9味药物。结论:栀子-川芎为最常用的活血解毒药对,贯穿AS治疗始末。导师辨治冠心病瘀毒证除活血解毒法外,亦重视理气化痰法的应用,组方以“活血解毒、理气化痰”为原则。2 实验研究研究一基于UPLC-Q-TOF-MSE技术分析栀子川芎化学成分及入血成分目的:明确栀子川芎体外化学成分及体内入血成分。方法:首先通过检索文献建立栀子川芎化学成分数据库,运用UPLC-Q-TOF-MSE技术分析栀子川芎与阴性对照品信息,利用Progenesis QI软件根据样本的精确分子量、保留时间及二级特征碎片离子对比推断成分,然后部分标准品比对验证,鉴定化学成分;其次,根据生物方剂分析药理策略,运用同上技术对栀子川芎能被C57BL/6J小鼠吸收入血的有效成分进行定性分析。结果:该研究通过UPLC-Q-TOF-MSE技术和Progenesis QI软件共鉴定和表征出栀子苷、京尼平苷酸、羟异栀子苷、京尼平-龙胆双糖苷、藏红花酸、西红花苷Ⅰ-Ⅲ、阿魏酸、藁本内酯、咖啡酸、香草酸、棕榈酸、奎宁酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、4-羟基-3-丁基苯酞、正丁基苯酞、欧当归内酯A、丁烯基苯酞共20种化学成分。除外西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ外,有18种原型成分吸收入血,分为环稀醚萜类、二萜类、有机酸类、苯酞类和内酯类成分。结论:该研究借助UPLC-Q-TOF-MSE技术鉴定和表征出栀子川芎20种化学成分和18种入血原型成分。为阐明栀子川芎药效物质基础和后续抗AS机理研究提供依据。研究二 栀子川芎抗动脉粥样硬化易损斑块的效应研究目的:观察栀子川芎对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化易损斑块的影响,明确其效应特点。方法:高脂饲料饲养ApoE-/-小鼠9周形成AS早期病变后,按低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）水平采用区组随机法分为模型组、辛伐他汀组、DNA甲基转移酶抑制剂组（5-aza-2’-deoxycytidine,DAC组）、栀子川芎高剂量组、栀子川芎中剂量组、栀子川芎低剂量组,C57BL/6J小鼠作为空白对照组,药物干预12周。运用小动物超声观测左颈总动脉脉搏波传导速度（Pulse wave velocity,PWV）、升主动脉内中膜厚度（Intima-media thickness,IMT）;运用油红O大体染色,评估主动脉大体斑块面积及斑块分布情况;运用HE染色评估主动脉窦部斑块纤维帽、坏死核心面积,Movat五色套染技术评估泡沫细胞及胶原纤维含量;运用全自动生化分析仪（AU480）检测 ApoE-/-小鼠总胆固醇（Total cholesterol,TC）、LDL-C、甘油三酯（Triglyceride,TG）及高密度脂蛋白胆固醇（High density liptein cholesterol,HDL-C）水平;运用酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor α,TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）和细胞间黏附分子-1（Intercellularcelladhesionmolecule-1,ICAM-1）炎症因子水平。应用上述检测手段综合评价栀子川芎对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的干预效果。结果:左颈总动脉PWV检测,与模型组相比,辛伐他汀组、栀子川芎高剂量组、中剂量组和低剂量组PWV减慢（P＜0.05）;升主动脉IMT检测,与模型组相比,空白组、辛伐他汀组、栀子川芎高剂量组、中剂量组和低剂量组IMT降低（P＜0.01）;主动脉大体油红O染色显示,与模型组相比,辛伐他汀组、DAC组、栀子川芎高剂量组、中剂量组和低剂量组大体斑块面积降低（P＜0.01,P＜0.05）;主动脉窦部HE染色坏死核心面积占斑块面积比例显示,与模型组相比,辛伐他汀组、栀子川芎中剂量组和低剂量组坏死核心面积降低（P＜0.01,P＜0.05）;主动脉窦部Movat染色显示,与模型组相比,辛伐他汀组、DAC组、栀子川芎高剂量组、中剂量组和低剂量组泡沫细胞含量降低（P＜0.01）,与模型组相比,辛伐他汀组、栀子川芎高剂量组和中剂量组胶原纤维含量升高（P＜0.01,P＜0.05）;血脂水平检测,与模型组相比,空白组、辛伐他汀组、栀子川芎高剂量组TC和LDL-C水平降低（P＜0.01,P＜0.05）,空白组及药物干预各组TG水平显著降低（P＜0.01）,DAC组、栀子川芎中剂量组HDL-C水平升高（P＜0.05）;炎症因子水平检测,与模型组相比,空白组、辛伐他汀组、DAC组、栀子川芎高剂量组和中剂量组IL-6、ICAM-1水平降低（P＜0.01,P＜0.05）,空白组、辛伐他汀组、栀子川芎高剂量组和中剂量组TNF-α水平降低（P＜0.01,P＜0.05）。结论:本研究对栀子川芎稳定动脉粥样硬化易损斑块进行效应评价,发现栀子川芎可减慢ApoE-/-小鼠左颈总动脉脉搏波传导速度、降低升主动脉内中膜厚度,减少主动脉大体斑块面积、主动脉窦部坏死核心面积及泡沫细胞含量且升高胶原纤维含量,同时降低血脂、炎症因子水平,通过多途径起到稳定AS易损斑块的作用。研究三 栀子川芎抗动脉粥样硬化的全基因组甲基化捕获测序分析目的:通过SureSelectXT甲基化靶向序列捕获平台预测栀子川芎调控DNA甲基化的作用特点,识别差异甲基化位点及作用途径。方法:以小鼠主动脉弓为研究对象,运用安捷伦SureSelect甲基化捕获测序技术,观察空白组、模型组、DAC组、栀子川芎高剂量组、栀子川芎中剂量组和栀子川芎低剂量组全基因组甲基化谱,筛选差异甲基化位点及甲基化区域,进行GO及KEGG功能富集分析。然后通过CB-Dock和Discovery Studio工具将研究一检测到的栀子川芎入血成分与筛选出的差异甲基化基因及信号通路核心蛋白进行分子对接预测。结果:按Pvalue＜0.05,|diff|值＞0.1的阈值,模型组比空白组共鉴定出80736个差异甲基化位点,其中高甲基化位点40957个,占50.73%,低甲基化位点39779个,占比49.27%;阳性药DAC组与模型组相比,呈现整体去甲基化趋势,低甲基化位点占总差异甲基化位点的62.53%;栀子川芎高剂量组、中剂量组和低剂量组与模型组相比,高甲基化位点与低甲基化位点各占总差异甲基化位点的50%左右,呈现双向调节甲基化的作用特点。差异靶基因功能富集分析显示,栀子川芎可调控RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、GTP酶活性的正向调节、正调控转录DNA模板化、细胞内信号转导等生物学过程,参与MAPK、PI3K-AKT、Hippo、Notch、TNF、HIF-1、Apoptosis 等信号通路。其中,栀子川芎三个剂量组均可调控MAPK信号通路,可见MAPK信号通路是栀子川芎调控的关键通路,蛋白互作网络筛选到MAPK信号通路上FGFR3、AKT1、RAPIA等核心基因。分子对接结果显示栀子川芎至少13种入血成分与差异甲基化基因FGFR3、AKT1、RAP1A对接紧密,Vina得分＜-7.0kcal/mol,最少7种入血成分和MAPK信号通路核心蛋白ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、P38MAPK对接Vina得分＜-7.0kcal/mol,对接相互作用力以氢键、范德华力及疏水相互作用为主。结论:栀子川芎对差异甲基化基因呈现双向调控特点,通过多靶点、多途径治疗动脉粥样硬化;差异甲基化基因涉及MAPK、PI3K-AKT、Apoptosis、Hippo等信号通路;分子对接结果显示,栀子川芎入血成分与差异甲基化基因、MAPK信号通路核心蛋白结合紧密,可进一步验证。研究四基于FGFR3甲基化调控MAPK/ERK信号通路探讨栀子川芎抗动脉粥样硬化的作用机制目的:探索栀子川芎调控FGFR3基因启动子区甲基化影响下游MAPK/ERK信号通路,进而抑制细胞凋亡的效应机制。方法:本节以研究三的预测结果为依据,通过焦磷酸测序（Pyrosequencing,Pyro）技术验证FGFR3基因启动子区甲基化水平;运用实时荧光定量聚合酶链式反应法（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）检测FGFR3 mRNA和蛋白的表达;WB法检测MAPK信号通路核心蛋白P-MEK1/2、MEK1/2、P-ERK1/2、ERK1/2的表达;WB法检测凋亡相关因子BCL-2、BAX、Cleaved Caspase-3的蛋白表达;免疫荧光法（immunofluorescence technic,IF）进行细胞凋亡 TUNEL 染色。结果:焦磷酸测序表明,与模型组相比,空白组、栀子川芎中剂量组和低剂量组FGFR3 chr5.33723633位点启动子区甲基化水平升高（P＜0.01,P＜0.05）,空白组、栀子川芎高剂量组和低剂量组FGFR3 chr5.33723644位点启动子区甲基化水平升高（P＜0.01,P＜0.05）,空白组、栀子川芎低剂量组FGFR3 chr5.33723648和chr5.33723657位点启动子区甲基化水平升高（P＜0.01,P＜0.05）;qPCR实验显示,与模型组相比,空白组、栀子川芎高剂量组、中剂量组和低剂量组均可降低FGFR3 mRNA和蛋白磷酸化水平（P＜0.01）;WB实验表明,与模型组相比,空白组、栀子川芎高剂量组、中剂量组和低剂量组P-MEK1/2/MEK1/2、P-ERK1/2/ERK1/2 蛋白相对表达量明显降低（P＜0.01,P＜0.05）;与模型组相比,空白组和栀子川芎高剂量组Bax蛋白表达量降低（P＜0.01,P＜0.05）,空白组、栀子川芎高剂量组、中剂量组和低剂量组Cleaved Caspase-3蛋白相对表达量降低（P＜0.01,P＜0.05）,Bcl-2蛋白相对表达量升高（P＜0.01,P＜0.05）,Bax/Bcl-2蛋白相对表达量明显降低（P＜0.01）;TUNEL染色结果表明,与模型组相比,空白组、栀子川芎高剂量组、中剂量组和低剂量组TUNEL阳性率明显降低（P＜0.01）。结论:栀子川芎可提高小鼠主动脉组织FGFR3基因启动子区甲基化水平,下调FGFR3的mRNA和蛋白磷酸化表达。栀子川芎稳定AS易损斑块的作用机制可能与升高FGFR3基因启动子区甲基化水平,下调基因表达,进而调控MAPK/ERK信号通路最终增加Bcl-2表达,降低Bax、Cleaved Caspase-3的表达和凋亡指数来抑制细胞凋亡相关。