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顺铂是全球三大抗肿瘤药物之一,它的广泛使用奠定了对金属抗肿瘤药物的肯定,钌配合物具有与铂相同的化学结构与性质,被认为是最有前途的金属抗癌药物之一。由于顺铂严重的毒副作用,促使人们开始关注并研究与铂具有相近抗肿瘤活性的金属钌配合物。
近年来,大多数研究发现钌配合物有低毒性、易吸收并可很快排泄的特点,由于配体和金属离子的协同作用,其药理活性有增强的趋势。这类化合物在肿瘤中分布浓度高说明易于被肿瘤组织吸收,并且具有与铂类化合物更佳的生物活性与更低毒性,有可能成为活性比顺铂更强的新型抗肿瘤药物,经过化学修饰有望成为最有前途的抗癌药物之一。
前期工作,通过设计合成不同的配体,改变辅助配体,以拆分的方法设计合成出了一系列手性钌联吡啶和手性钌菲哕啉配合物,并对这些化合物进行了表征,同时研究其Λ－异构体和△一异构体,得出Λ－异构体比△-异构体活性强大,经过一系列筛选,从众多手性钌配合物中筛选出活性最好的钌配合物Λ－[Ru(bpy)2(o-tFPIP)](Cl)2,即Λ－WH0402。
本课题从细胞生物学、实验动物学、分子生物学、病理形态学等方面,以顺铂的抗瘤作用为对照,通过筛选Λ－WH0402敏感肿瘤细胞株,检测Λ－WH0402对敏感肿瘤株的抗肿瘤活性；应用抗肿瘤转移、抑制血管作用等实验,研究了手性钌配合物Λ－WH0402的抗肿瘤活性作用,并对其作用机制进行初步探讨。
方法
1.通过MTT法筛选对Λ－WH0402敏感的肿瘤细胞株,并以顺铂为对照,通过体内外实验验证Λ－WH0402的疗效与毒性,确定对Λ－WH0402进行研究的必要性。
2.通过细胞爬片观察、扫描电镜观察、肿瘤细胞生长曲线观察、裸鼠体内成瘤实验观察Λ－WH0402对敏感肿瘤株生长的抑制作用；通过流式细胞实验、荧光显微镜观察、凋亡蛋白检测观察Λ-WH0402对敏感肿瘤株诱导凋亡的作用,分析Λ-WH0402对敏感肿瘤株的抗肿瘤活性作用机制。
3.Λ-WH0402敏感肿瘤细胞株HCCLM6为高转移潜能的肝癌细胞株,通过体外侵袭、运动、粘附实验,体内原位移植转移实验,观察Λ-WH0402对肿瘤侵袭和转移的影响。
4.通过Λ-WH0402对人脐静脉内皮细胞HUVEC的MTT实验、内皮细胞迁移实验、实验性体内血道肺转移的影响,观察Λ-WH0402对肿瘤血管的抑制作用。
结果
1.体外应用MTT生长曲线动态分析,对10种人肿瘤细胞株进行筛选,获得Λ-WH0402敏感肿瘤株为肝细胞癌高转移肿瘤细胞株HCCLM6。
2.通过体外MTT实验,体内裸鼠及C57小鼠实验,结果显示Λ-WH0402的疗效与顺铂接近,两者之间差异无显著性(P=0.028)；急性毒性结果显示,Λ-WH0402的LD50为11.66 mg/kg。
3.倒置显微镜观察、细胞爬片观察、扫描电镜观察,结果显示对照组HCCLM6细胞生长状态良好,实验组随Λ-WH0402剂量增加或培养时间的延长,细胞状态逐渐恶化,生长明显受到抑制。流式细胞仪检测细胞周期分布,结果显示当浓度达0.312μg/ml作用24h、48 h后,细胞周期主要阻滞在G0/G1期,当浓度达0.625、1.25μg/ml作用24h、48h后,细胞周期主要阻滞在S期。流式细胞仪、荧光染色、凋亡蛋白检测,结果显示Λ-WH0402能够诱导HCCLM6细胞凋亡。
4.体内裸鼠实验,在裸鼠右侧胁部皮下接种1×106、左侧接种2×105 HCCLM6细胞,建立双侧肿瘤小鼠模型,成瘤后次日在左侧肿瘤皮下注射生理盐水,右侧肿瘤的皮下注射水溶性Λ-WH0402,结果用双因素方差分析得出,Λ-WH0402用药组与未用药组裸鼠移植瘤体积,有显著性差异(F=20.242,P=0.001),瘤重用独立样本T检验,组间的瘤重有显著性差异(t=9.363,P=0.000),Λ-WH0402具有抑制HCCLM6裸鼠成瘤作用。
5.体外侵袭、粘附、运动实验结果显示,Λ-WH0402能够在体外抑制HCCLM6细胞的侵袭粘附及运动能力；动物体内原位移植实验结果表明,Λ-WH0402能够在裸鼠体内明显抑制原位移植后肝、肺、腹腔和腹壁转移。
6.内皮细胞的MTT实验结果表明,Λ-WH0402对内皮细胞增殖的抑制作用高于其敏感株HCCLM6细胞；内皮细胞迁移实验表明,Λ-WH0402能够抑制内皮细胞的迁移；小鼠体内实验性血道肺转移实验显示,Λ-WH0402用药组较对照组肺转移动物数(x2=4.000 P=0.046)、肺转移率、肺转移结节数(t=-6.357 P=0.000)明显减少。
结论
1.应用10株人肿瘤细胞株进行增殖活性筛选,得出肝细胞癌高转移细胞株HCCLM6是Λ-WH0402的敏感肿瘤细胞株。与顺铂相比较,Λ-WH0402抗瘤活性及急性毒性与顺铂接近。
2.Λ-WH0402通过阻滞细胞的DNA合成、抑制S期→G2期的转化而抑制HCCLM6细胞的生长,通过上调P53和Bax的表达,下调Bcl-2的表达而诱导HCCLM6细胞的凋亡。
3.Λ-WH0402抑制HCCLM6的体外粘附、侵袭及运动能力,在体内抑制肝细胞癌的实验性转移能力。
4.Λ-WH0402对内皮细胞HUVEC增殖抑制作用高于HCCLM6,能够抑制内皮细胞的迁移,抑制小鼠体内实验性血道肺转移。
本研究的创新之处
应用 Λ-WH0402对10种人肿瘤细胞株进行体外活性筛选,发现Λ-WH0402对10种人肿瘤细胞株有不同程度抑瘤作用,其中肝细胞癌高转移细胞株HCCLM6为金属钌配合物Λ-WH0402高敏感株。其抗瘤机制在于促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、阻滞肿瘤血管发生和抑制肿瘤细胞侵袭与转移等综合效应而发挥抗瘤作用。其总体效价与毒副作用与顺铂接近,值得进行临床前的研究。