在登革病毒编码的三种结构蛋白中,包膜E蛋白是病毒的主要结构蛋白,位于成熟病毒颗粒表面,构成病毒颗粒的突起。E蛋白在空间上形成3个不同的结构域(I, II和III区),在病毒吸附、与宿主细胞膜融合以及病毒组装过程中具有重要的作用。而且,E蛋白也是病毒的主要抗原,含有多种抗原表位,可通过诱发中和抗体产生保护性免疫应答,在机体抵御登革病毒感染的过程中发挥重要作用。然而,登革病毒E蛋白,特别是III区外的构象型中和表位的精细结构尚未完全阐明。其次,不同型和同一型毒株之间在抗体结合位点上的差异及其对病毒组织嗜性、复制效率及致病性等的影响也还有待于进一步分析。此外,E蛋白上与登革病毒免疫病理密切相关的ADE表位也知之甚少。这些问题阻碍了对登革病毒致病和免疫分子机理的阐明。因此,确定登革病毒E蛋白中和表位和ADE表位,阐明抗体中和作用的分子机制,以及进一步探讨与E蛋白重要生物学功能相关的一些关键氨基酸残基,不仅是了解其分子机制的第一步,也为登革特异性防治提供重要信息。本项研究利用登革2型病毒E蛋白特异单抗,分析了病毒E蛋白的中和表位,明确了抗体结合的关键位点及其中和作用的机制,并初步探讨了重要氨基酸位点突变对病毒生物学特性的影响。研究主要包括四个部分:一、登革2型病毒包膜E蛋白特异单克隆抗体的制备为了制备登革2型病毒E蛋白特异单抗,我们分别以灭活的登革2型病毒和构建的病毒全长prM-E基因的真核重组质粒DNA作为免疫原,采用常规方法建立分泌登革2型病毒E蛋白单抗的杂交瘤细胞系。最终获得了10株登革2型病毒特异单抗(2B8、2H11、2D7、2F2、2F10、2A10G6、2B4、2D5、4C10和6B4)。为了对这10株单抗所针对的病毒蛋白进行鉴定,我们以稳定表达登革2型病毒prME蛋白的细胞制备的抗原片对其进行IFA检测。结果证实,这10株杂交瘤细胞所分泌的单抗均是针对prM-E抗原的。然后,以大肠杆菌表达的E蛋白I-II区或III区为抗原,采用免疫印迹和ELISA法鉴定单抗所针对的抗原表位。结果发现,除2A10G6和2F10结合E蛋白I-II区外,其余单抗均针对E蛋白III区。此外,对这些单抗的交叉反应活性测定结果显示,2B8、2H11、2D7和2F2是登革2型病毒特异的,而其余6株均具有黄病毒交叉反应活性。上述结果表明,我们获得了针对登革2型病毒E蛋白不同的结构域、对黄病毒属成员具有不同反应性的单抗,为E蛋白抗原表位分析、登革新的诊断试剂以及新型疫苗和抗病毒药物研究提供重要工具。二、登革2型病毒E蛋白特异单克隆抗体的中和作用机制我们采用蚀斑中和减少试验和乳鼠保护试验观察这10株登革2型病毒E蛋白特异单抗的中和活性和保护作用。结果显示,三株单抗(2B8、2A10G6和2F10)对登革2型病毒具有较强的中和活性和免疫保护作用。其中E蛋白I-II区特异单抗2A10G6强于III区特异单抗2B8,该抗体可在登革病毒感染4h和24h后分别使66.7%和40%的小鼠存活。此外,单抗2A10G6还有效中和登革1、3和4型、黄热和西尼罗病毒,与目前已知的黄病毒交叉中和抗体比较,具有更加广谱的黄病毒交叉中和活性。为了确定登革病毒E蛋白特异抗体中和作用的机制,我们采用定量RT-PCR法和蚀斑法测定单抗(2B8和2A10G6)是在病毒增殖周期中的哪一个阶段抑制病毒的感染。结果显示,2B8主要抑制登革病毒增殖周期中的吸附阶段,抑制倍数达3.1;而2A10G6可在病毒吸附后的病毒E蛋白与宿主细胞膜融合阶段发挥其中和作用。上述结果说明,这2株中和抗体可通过结合其不同的中和表位在病毒增殖周期的初期阶段抑制登革病毒的感染。另一方面,我们在人单核细胞K562上观察了亚中和浓度的单抗2A10G6是否可增强登革1-4型病毒对表达Fcγ受体的单核细胞的感染。结果发现,亚中和浓度的单抗2A10G6可增强4个型登革病毒对单核细胞的感染,增加倍数达5-10倍,表明该中和抗体具有感染增强活性。三、登革2型病毒E蛋白中和表位的筛选与鉴定为了分析登革病毒E蛋白中和表位,我们首先采用噬菌体随机肽库对单抗2A10G6结合的多肽进行筛选。结果显示,该单抗所对应的多肽序列位于登革2型病毒E蛋白融合多肽的98DRXW101区域。采用ELISA法进一步证实了相应的合成多肽可与单抗2A10G6特异结合。序列比对发现,该多肽序列在所有黄病毒的E蛋白氨基酸序列中是高度保守的。根据E蛋白晶体结构,我们发现由D98、R99和W101位氨基酸残基可构成一个2A10G6结合的构象型表位,该表位暴露在登革2型病毒E蛋白II区顶端融合多肽的表面,且其空间构象在不同黄病毒E蛋白结构中是较为保守的。为了确定单抗2A10G6与E蛋白结合的关键位点,我们利用免疫印迹观察D98、R99和W101位突变对抗体结合活性的影响。结果显示,当D98R和R99G单独突变时,2A10G6与E蛋白的结合不受影响;当W101R突变时,2A10G6几乎不能与E蛋白结合。当这些氨基酸位点组合突变时,2A10G6结合活性基本上丧失。表明登革病毒E蛋白融合多肽内的W101位可能是2A10G6与其结合的关键位点,而D98和R99位氨基酸对抗体结合也可产生一定的影响。此外,我们通过抗体压力筛选和蚀斑纯化,获得了1株可逃逸单抗2A10G6中和的突变株。序列测定发现,该突变株在登革2型病毒E蛋白第126位处氨基酸发生了突变(Glu→Lys),表明登革2型病毒E蛋白126位氨基酸是单抗2A10G6特异识别的氨基酸位点,该位点可与D98、R99和W101位共同形成2A10G6表位。同时,这株逃逸株具有与亲本株相似的病毒复制效率,但乳鼠神经毒力明显降低,表明E蛋白126位氨基酸是登革2型病毒的毒力相关位点。四、登革2型病毒E蛋白特异嵌合抗体的构建及其生物学特性为了探讨抗体Fc区介导的效应器功能以及为下一步构建人源化抗体提供理论依据,我们首先用5’RACE法测定并预测了鼠源抗体2A10G6的轻重链可变区序列中可能的互补决定区(Complementarity-determining region,CDR)和框架区(Framework region,FR)。结果显示,重链可变区的3个CDR区氨基酸序列依次为EYTMH、GIDPNNGGTNYNQKFKG和RDYYALDY;轻链可变区的3个CDR区氨基酸序列依次为KASQHVGSAVA、SASNRYT和QQYNSYPT。在此基础上,我们分别构建了嵌合抗体轻重链的真核表达载体,共转染CHO细胞,经G418压力筛选获得可稳定分泌登革病毒E蛋白特异嵌合抗体的细胞株,且该抗体具有与亲本鼠源抗体相似的抗原结合和中和活性。本研究为分析E蛋白的结构与功能、阐明登革病毒致病和免疫的分子机理奠定了理论基础,也为研制新型疫苗和抗病毒药物提供了重要信息。