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选题依据:远志是我国重要的大宗药材之一,具有安神益智、交通心肾、祛痰、消肿之功效。皂苷类物质是远志发挥安神益智作用的主要活性成分,非常适合开发成为抗衰老及脑保护的新药。但有两个方面的因素制约着远志皂苷的商品开发。从远志资源方面讲,上世纪80年代起,远志药材逐渐从野生生长过渡为人工种植,由于没有规范化的种植管理模式,其目前面临着几个问题:远志属植物品种繁多,我国有远志属植物42种8变种,广泛分布于东北、华北、西北和华中以及四川等地,且古代多个品种均可入药;没有商品化的种子;在人工种植过程中,壮根灵等过度使用。这些使远志药材质量不均一,种质逐渐退化。从获得难易方面讲,远志皂苷苷元种类多样、结构复杂,且化合物中手性中心多,导致单个苷元衍生出的皂苷结构更加复杂繁多,从而使其单体难以从植物中分离纯化;用化学合成手段得率又不高。这些均限制了远志皂苷开发成为脑保护的新药。天然产物的异源合成为远志皂苷的开发提供了新思路,即通过研究远志皂苷合成途径中的催化酶,再将合成途径导入微生物细胞,从而大量获得天然产物或其前体。在这一过程中,研究参与远志皂苷生物合成途径中的关键酶显得至关重要。本课题组前期研究结果发现,CYP716A249可能以β-香树脂醇为底物,催化其生成远志皂苷苷元齐墩果酸。因此,本研究首先以酿酒酵母W303a为底盘菌,通过改造其内源基因、引入外源β-AS基因,得到高产β-香树脂醇的酿酒酵母细胞,为CYP716A249的功能验证提供底物。再构建产齐墩果酸的酵母工程菌,为远志皂苷后续CYP450酶的功能验证提供平台。然后对CYP716A249的生物信息学及其在不同生长年限远志的不同组织中mRNA表达水平进行分析,得到CYP716A249的基本概况。最后以产β-香树脂醇的酵母细胞为底盘菌,对CYP716A249的功能进行验证。这进一步推动了远志皂苷生物合成途径的阐明,并为远志皂苷的开发利用奠定基础。目的:1.构建高产β-香树脂醇的酵母工程菌,为远志CYP716A249的功能验证提供底物。2.构建产齐墩果酸的酵母工程菌,为远志皂苷后续CYP450酶的功能验证提供平台。3.验证远志CYP716A249的功能。方法:1.通过酶切连接法构建tHMGR、ERG20过表达载体,采用同源重组及重叠延伸PCR(OE-PCR)技术构建光果甘草GgbAS表达载体,采用醋酸锂转化方法将3个载体转入酵母细胞W303a中,使酵母中引入外源β-AS基因同时内源基因得到调控,最终获得高产β-香树脂醇的酿酒酵母细胞。2.采用酶切连接法及OE-PCR技术,构建苜蓿OAS联合百脉根CPR(MtOAS-CPR)的表达载体,转入产β-香树脂醇的酵母细胞,LC-MS检测齐墩果酸产量,得到产齐墩果酸的酵母工程菌。3.运用软件DNAstar、MEGA 5.1及https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/、http://web.expasy.org/protparam/、https://www.genscript.com/psort.html、http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search、http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/网站提供的在线分析工具,对远志CYP716A249的核苷酸序列及氨基酸序列进行分析;通过荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析CYP716A249在不同生长年限远志的不同组织中mRNA表达水平。4.采用酶切连接法及OE-PCR技术,构建远志CYP716A249联合百脉根CPR(PtOAS-CPR)的表达载体,转入产β-香树脂醇的酵母细胞,LC-MS检测代谢物中有无齐墩果酸生成,从而鉴定CYP716A249的功能。结果:1.构建了tHMGR、ERG20、GgbAS的过表达载体。酵母中转入GgbAS可使其产生1.98 mg/L的β-香树脂醇;调控ERG20使β-香树脂醇的产量升高了1.19倍,为4.35 mg/L;同时调控tHMGR及ERG20则使β-香树脂醇产量升高4.3倍,为10.51mg/L。2.构建了MtOAS-CPR表达载体,转入产β-香树脂醇的酵母中,齐墩果酸的产量为1.30 mg/L。得到产齐墩果酸的酿酒酵母工程菌。3.通过软件及在线工具,分析及预测CYP716A249的序列及功能,得出CYP716A249为亲水性蛋白,不稳定,主要存在于线粒体上,在远志中极有可能为催化β-香树脂醇生成齐墩果酸的酶。RT-qPCR结果得出,CYP716A249在二年生远志根中的表达量最高。4.构建了PtOAS-CPR表达载体,转入产β-香树脂醇酵母工程菌,可检测出有齐墩果酸生成。得出CYP716A249为远志中的齐墩果酸合酶(OAS),可以β-香树脂醇为底物生成齐墩果酸。结论:本研究以酿酒酵母作为底盘菌,构建了产β-香树脂醇及齐墩果酸的酵母工程菌,并对远志中的齐墩果酸合酶CYP716A249进行功能鉴定,推进了远志皂苷生物合成途径的阐明,加快了远志皂苷在酵母体内异源合成的步伐,为远志皂苷的开发利用奠定基础。