【摘 要】
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牛病毒性腹泻-黏膜病(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的病毒性传染病,主要感染牛,表现为呼吸系统、消化系统疾病和致死性黏膜病,对世界养牛业造成极大的危害,引起国内外学者对于BVDV致病机制研究的重视。研究表明BVDV非结构蛋白(Non-structrual protein)4B在病毒
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牛病毒性腹泻-黏膜病(Bovine viral diarrhea,BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的病毒性传染病,主要感染牛,表现为呼吸系统、消化系统疾病和致死性黏膜病,对世界养牛业造成极大的危害,引起国内外学者对于BVDV致病机制研究的重视。研究表明BVDV非结构蛋白(Non-structrual protein)4B在病毒复制过程中发挥重要作用,此外NS4B还具有RNA结合活性和NTP酶活性,能够诱导膜复制,参与病毒感染细胞膜的重排过程。本研究采用酵母双杂交方法,筛选出与BVDV NS4B蛋白相互作用的宿主蛋白。PCR扩增BVDV NS4B基因,将其与pGBKT7载体连接,构建诱饵质粒pGBKT7-NS4B并转入Y2H Gold酵母感受态细胞,经验证pGBKT7-NS4B诱饵质粒无自激活活性和毒性,诱饵质粒可用于后续酵母双杂交实验。提取牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cells,MDBK)RNA,经LD-PCR得到ds cDNA,将其与pGADT7-Rec载体连接构建牛肾细胞cDNA文库,文库库容约为3.4×10~6cfu/mL,均一化程度良好,可用于酵母双杂交筛选。将pGBKT7-NS4B诱饵质粒与MDBK cDNA文库进行双杂交,初筛得到LYZ1、PSMC4、Bak1、MKRN1、TP53BP2和CKM等6种与NS4B蛋白有相互作用的宿主蛋白。从初筛蛋白中选择Bak1蛋白构建pGADT7-Rec-Bak1猎物质粒与NS4B诱饵质粒进行点对点杂交鉴定;构建pGBKT7-Bak1诱饵质粒及pGADT7-Rec-NS4B猎物质粒进行反交鉴定,鉴定结果均为阳性,证明Bak1蛋白与BVDV NS4B蛋白存在互作。从宿主细胞文库中筛选到与BVDV NS4B蛋白互作的宿主蛋白Bak1,为细胞凋亡正调节因子,表明NS4B蛋白可能参与BVDV感染细胞后诱导凋亡的过程。这为进一步阐明BVDV在宿主细胞内感染的分子机制奠定基础。
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