论文部分内容阅读
背景阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的中枢神经系统退行性疾病,其预防及临床治疗迄今仍是世界性难题。AD发病机制复杂,主要有β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉积、Tau蛋白过度磷酸化、氧化应激等。近年研究表明,突触丢失是AD最早的标志之一,突触可塑性蛋白异常及其棕榈酰化修饰与AD的进展联系紧密。突触后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD-95)是标志突触功能的关键蛋白,也是神经系统棕榈酰修饰信号通路的关键靶点,且其棕榈酰化修饰决定了PSD-95的功能及AD病理的突触稳定性。胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)是星形胶质细胞的标志且对神经元损伤有保护作用。我们前期的研究证实,临床上广泛用于治疗神经损伤的脑苷肌肽(Cattle Encephalon Glycoside and Ignotion Injection,CEGI)对AD模型小鼠有多靶点神经保护作用。目前,关于CEGI通过影响PSD-95棕榈酰化来改善认知功能的研究尚无报道。目的应用APP/PS1小鼠模型,通过行为学检测、免疫共沉淀和免疫组织化学方法,探讨CEGI对AD的干预,为探寻其在临床上预防和治疗AD的有效作用提供理论依据和新思路。方法1.动物分组及给药:5月龄APP/PS1双转基因AD模型小鼠48只及同龄同背景正常C57BL/6J 12只,分为5组,每组12只,分别为正常对照组(nTg组)、模型组(Tg组)、脑苷肌肽组(Tg+CEGI组)、N-(tert-Butyl)hydroxylamine(NtBuHA)组(Tg+NtBuHA组)、多奈哌齐组(Tg+Donepezil组),各组分别给予生理盐水、CEGI、NtBuHA、多奈哌齐,给药6周。2.行为学检测:停药后进行Morris水迷宫实验。3.皮层及海马形态学分析:小鼠麻醉后心脏灌注,取脑组织。左半部分脑组织用于组织学检测,免疫荧光法(IF)检测PSD-95、NR2B、SYT1的表达,免疫组化法(IHC)检测Aβ、GFAP、NeuN的表达。4.生物化学及分子生物学检测:右半脑组织分别用于酰基生物素交换法(acyl-bioton exchange assay,ABE)检测PSD-95的棕榈酰化水平,化学比色法测定SOD、MDA的表达水平及酶联免疫吸附法(ELISA)测定Aβ的含量。结果1.给药过程中,小鼠未出现异常及死亡现象,说明各个药物对APP/PS1小鼠无明显的毒性作用;通过比较nTg组和Tg小鼠皮层Aβ的含量,证实该批次模型小鼠满足本课题研究。2.Morris水迷宫实验结果显示,CEGI能够增加AD小鼠在目标象限停留的时间。3.CEGI能够显著降低AD小鼠皮层PSD-95棕榈酰化修饰水平。4.CEGI能够显著降低AD小鼠皮层Aβ的表达水平。5.CEGI能够改善AD小鼠皮层的突触损伤,显著增加PSD-95、NR2B及SYT1的表达。6.CEGI能够降低AD小鼠海马GFAP的表达,增加皮层NeuN的表达;在氧化应激方面,CEGI能够增加AD模型小鼠脑内SOD的活性,降低MDA的含量。结论研究发现,对实验小鼠连续给药6周后,APP/PS1双转基因AD模型小鼠的空间学习记忆能力有显著改善,表明CEGI对AD有一定的治疗作用,这种作用可能与以下方面有关:1.CEGI抑制AD模型小鼠皮层Aβ的沉积,从而减轻Aβ的神经毒性。2.CEGI对突触的保护作用可能与降低PSD-95棕榈酰化水平和改善突触相关蛋白表达相关。3.CEGI能降低GFAP表达,增加NeuN水平,抑制氧化应激损伤。