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根据统计,白血病发病率约占肿瘤总发病率的3%左右,是儿童和青年中最常见的一种恶性肿瘤。白血病的发病率在世界各国中,欧洲和北美发病率最高,其死亡率约为3.2-7.4/10万人口。亚洲和南美洲发病率较低,死亡率为约2.8-4.5/10万人口。白血病的治疗目前主要有下列几类治疗方法:化学治疗、放射治疗、靶向治疗、免疫治疗、干细胞移植等方法。化疗法易使细胞产生耐药性,副作用大,而较为有效的骨髓移植也因配型难找,花费大,应用上有所限制。因此,寻找一种高效、特异性杀伤恶性肿瘤细胞的新抗癌资源成为癌症治疗的主要研究方向。抗菌肽ABP-CM4是由36个氨基酸组成的阳离子抗菌肽,具有一定的抗癌活性,但是抗癌活性并不高,并且对多数恶性肿瘤细胞株不敏感,如何提高ABP-CM4的抗癌活性而不影响其选择性成为迫切需要研究的课题。豆蔻酰化修饰是蛋白质翻译后的重要修饰类型,在介导蛋白质-蛋白质、蛋白质-生物膜相互作用中发挥着重要的作用。本研究首先分析了 CM4对白血病细胞的作用,进一步设计了新型豆蔻酰化修饰的ABP-CM4(Myr-CM4),并比较分析豆蔻酰基对ABP-CM4杀伤白血病细胞作用的影响,初步探讨作用机制,结果如下:1.比较分析ABP-CM4与蜂毒肽melittin对白血病细胞K562杀伤机理,MTT结果表明,melittin对白血病细胞K562的杀伤活性显著高于ABP-CM4,IC50为4μ M,ABP-CM4对白血病细胞K562的IC50为20μM。Annexin-V/PI双染的流式细胞分析结果表明,melittin可诱导K562细胞凋亡,而ABP-CM4对K562细胞的作用是引起细胞坏死。进一步分析发现,melittin和ABP-CM4都可以引起K562细胞质膜通透性变化,破坏细胞骨架结构,并且melittin还能引起K562细胞内Ca2+的释放。因此,ABP-CM4与melittin以不同的方式发挥对白血病K562细胞的杀伤作用。2.对ABP-CM4的N端进行豆蔻酰化修饰得到Myr-CM4。通过MTT检测Myr-CM4对K562/ADR、Jurkat、HL-60三种白血病细胞的杀伤活性,结果表明,豆蔻酰基修饰显著增强ABP-CM4对白血病细胞得杀伤活性,活性增强了 6-8倍,Myr-CM4对白血病细胞的IC50约3-4μM。豆蔻酰基也能增强ABP-CM4对L02、HEK-293、NIH-3T3三种正常细胞的毒性,然而在4μM时,Myr-CM4对三种正常细胞无毒性;60μ M时,L02、HEK-293和NIH-3T3细胞仍有84.45%、74.57%和69.48%的存活率。溶血活性分析结果表明,豆蔻酰基也能增强ABP-CM4对小鼠红细胞的溶血活性,然而在20μM时,Myr-CM4无溶血活性;60μM时,溶血活性约40%。综上结果表明,豆蔻酰基能显著增强ABP-CM4对白血病细胞的杀伤作用,但是仍表现出对正常细胞低毒作用。3.荧光标记结合流式细胞分析表明,豆蔻酰基显著增强ABP-CM4与白血病细胞的结合能力,同时也能增强ABP-CM4与正常细胞的结合能力,但是对白血病细胞结合能力的增强大于对正常细胞约6-20倍。可见豆蔻基可能通过增强与细胞的结合能力增强对白血病细胞与正常细胞的毒性。4.探讨Myr-CM杀伤白血病细胞的机制,LDH分析结果表明,Myr-CM4在3μM浓度时,对K562/ADR和Jurkat细胞膜损伤约10%;在30μ M的浓度下对K562/ADR细胞膜损伤达30%,对Jurkat细胞膜损伤没有明显改变。Annexin-V/PI双染的流式细胞分析结果显示,3μ M的Myr-CM4能引起K562/ADR细胞18.53%的凋亡细胞,10.58%的细胞坏死,在6μM时引起51.93%的细胞凋亡,15.89%的细胞坏死。可见,诱导坏死和凋亡是Myr-CM4杀伤K562/ADR细胞的方式。诱导凋亡是Myr-CM4杀伤Jurkat细胞的主要方式,DNALadder实验进一步证实了 Myr-CM4可诱导Jurkat细胞的凋亡。5.ROS实验结果表明,Myr-CM4诱导Jurkat细胞内活性氧的增高,表明Myr-CM4破坏线粒体的功能。Rh123和FITC-Myr-CM共定位结果表明,Myr-CM4可跨膜转运至Jurkat细胞胞内并定位于线粒体膜上,并能改变线粒体膜电位,引起线粒体膜去极化。Myr-CM4能提高凋亡促进蛋白Bax表达,降低凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,引起Caspase9和Caspase3的切割。因此,Myr-CM4可能通过线粒体依赖途径诱导Jurkat细胞的凋亡。6.对牛乳铁蛋白肽Lactoferricin B(Lfcin B)进行N端豆蔻酰化修饰,得到Myr-LfcinB。MTT毒性分析表明,豆蔻酰基能显著增强Lfcin B对白血病的杀伤活性,并可以引起细胞的凋亡。综上所述,本研究开展了新型豆蔻酰化修饰抗菌肽CM4对白血病细胞的杀伤作用分析,认为豆蔻酰化能够显著增强抗菌肽CM4对白血病细胞的抗癌活性。豆蔻酰基能增强抗菌肽与细胞表面的结合能力,介导抗菌肽的跨膜转运,并可以通过作用线粒体诱导白血病细胞的凋亡。虽然豆蔻酰化修饰也能增强抗菌肽CM4对正常细胞的毒性以及溶血性,但是在对肿瘤细胞作用浓度下并没有表现出对正常细胞的毒性与溶血活性,表现出较好的选择性。本研究认为,豆蔻酰化修饰是提高抗菌肽抗癌活性的有效方法,但是也应该考虑其对正常细胞毒性的影响。本研究结果为推动抗菌肽成为高效低毒的抗白血病药物提供了新的方法。