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目的:研究高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1,HMGB1)在慢性低氧及野百合碱致肺动脉高压中的作用和机制. 方法:(1)建立慢性常压低氧(氧浓度为10%,缺氧时间分别为1w,2w,3w,4w)及野百合碱(Monocrotaline,MCT,给予野百合碱单次腹腔注射,给药剂量为50mg/kg,给药时间分别为1w,2w,3w)两种肺动脉高压大鼠动物模型,并用HMGB1抑制剂甘草酸铵盐(Glycyrrhizin,Gly)及HMGB1中和抗体(anti-HMGB1neutralizing antibody,anti-HMGB1)行腹腔注射干预上述两种模型.(2)待模型到期后,使用powerlab血流动力学数据采集分析系统对上述各组模型的血流动力学指标(肺动脉压,右心室收缩压,体循环动脉压,心输出量,肺血管阻力)进行测定并计算右心室质量指数.(3)肺组织石蜡切片的HE染色和免疫组织化学染色,分别观察肺血管管壁的厚度变化及HMGB1组织分布及表达情况.(4)采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质免疫印迹(western blotting)技术分别检测HMGB1的信使RNA(mRNA)和HMGB1蛋白的表达水平,并同时用western blotting检测PI3K/Akt信号通路相关分子的表达变化.(5)使用钙离子探针fura-2/AM进行肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)胞浆钙浓度动态检测.(6)使用细胞免疫染色技术检测HMGB1在PASMCs的定位情况.(7)使用Cell Counting Kit-8(CCK8)和划痕愈合分别检测PASMCs的增殖和迁移情况.(8)采用大鼠HMGB1酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测正常大鼠及两种模型大鼠血浆中HMGB1的含量. 结果:(1)成功建立慢性低氧和野百合碱两种肺动脉高压模型,且通过血流动力学检测证实肺动脉压力,右心室收缩压,肺血管阻力显著高于正常,右心室质量指数也较正常大鼠显著增加,同时肺组织苏木素-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色显示肺血管中层显著增厚(Figure1and2).(2)实时定量PCR和蛋白质印迹实验分别显示较正常大鼠肺组织,低氧性肺动脉高压大鼠的肺组织HMGB1的mRNA和蛋白表达量增加,MCT模型中HMGB1mRNA表达量增加,但HMGB1蛋白单体表达减少;但在两种模型中一致的是HMGB1聚合体形式的表达量增加且聚合体与单体的比值均显著高于正常(Figure3).(3)PASMCs免疫染色技术显示过氧化氢及低氧暴露能够引起HMGB1从核向胞浆转位,且低氧诱导的HMGB1转位现象能够被过氧化氢酶catalase所阻断,另外在低氧暴露的肺动脉平滑肌细胞上清中及两种肺动脉高压模型的血浆中HMGB1水平也显著高于正常;另外肺切片免疫组织化学染色显示较正常大鼠肺组织,HMGB1在慢性低氧4w的肺动脉高压肺组织中表达量增加,但在野百合碱3w大鼠模型中表达减少,且在两种模型均出现HMGB1的胞浆转位情况(Figure4).(4)重组型HMGB1蛋白可以激活表达在PASMCs细胞膜上的Toll样受体4(toll like receptor4,TLR4),最终开放经典瞬时受体电位通道TRPC(classical transient receptor potential)通道引起PASMCs胞浆钙浓度增加,且这一效应能够被TLR4抑制剂TAK-242和TRPC抑制剂2-APB及SKF-96365所阻断(Figure5).(5)重组型HMGB1能够激活PI3K/Akt信号通路且能够促进PASMCs的迁移,但对PASMCs增殖无显著影响(Figure6).(6)HMGB1抑制剂甘草酸铵盐(Glycyrrhizin,Gly)能够部分抑制上述两种肺动脉高压模型的形成,主要表现在与单纯模型组相比,GLy干预组肺动脉压力及右心室收缩压下降,右心室质量指数(right ventricular/left ventricular+septal,RV/LV+S)降低,肺血管重塑程度减轻(Figure7).(7)Gly干预能够部分抑制PI3K/Akt信号通路的活化,且这一机制可能参与其对低氧性肺动脉高压形成的抑制作用(Figure8).(8)HMGB1中和抗体能够部分阻断低氧及野百合碱所致的两种肺动脉高压模型的形成,表现为肺动脉压,右心室压,肺血管阻力,右心室质量指数的降低及肺血管重塑的改善(Figure9). 结论:HMGB1在慢性低氧及野百合碱致肺动脉高压的发生机制上有重要作用,为肺动脉高压的临床治疗提供新的临床前研究线索,同时为寻求新的用于肺动脉高压诊断的生物标志物提供临床前研究依据.