研究背景肿瘤细胞的微环境在肿瘤的发生和发展中占有至关重要的作用。解整合素金属蛋白酶ADAMs(A Disintegrin and Metalloproteases)是一类Zn2+依赖性的胞外肽酶,在肿瘤细胞微环境的调节中有着一定的作用。由于这类蛋白质分子都含有金属蛋白水解区及解整合素区,因此将这类蛋白称为ADAMs[1]。它们在生物的发育、生存过程中的作用是多方面的,包括细胞的融合与迁移、生物活性因子的附着、释放、受精、以及细胞内信号传导等[2]。本课题组一直致力于以ADAM17为代表的炎症方面的研究并取得了一定的进展,如对三类TACE(ADAM17)抑制剂作用机理的探讨[3]。有研究表明ADAM17可定位于人脑的神经元,AD(Alzheimer’s disease)患者的ADAM17表达水平虽然没有变化,但在老年斑和神经原纤维缠结中也发现了ADAM17。同时ADAM10与APP的体内加工有密切关系,由此级联到其上游前体蛋白加工酶PC7,从而探讨其在转基因后的生物学效应成为本课题组研究的新靶点。ADAMs在淀粉样蛋白前体加工中起重要作用,目前证实,一些因淀粉样蛋白前体沉积造成的神经系统疾病,与ADAMs的蛋白水解活性降低有密切关系[4]。后来又新奇的发现这类家族基因在肿瘤细胞中高表达。并且已有研究表明有些分泌型ADAMs,如ADAM11和ADAMTS-1,在某些肿瘤细胞系表达,表明它们可能与肿瘤形成有关。文献中已有相关报道[5,6,7],ADAM17高表达于肿瘤组织中,它主要以前体的方式定位于肿瘤细胞表面其中包括乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠癌和前列腺癌等,ADAM10在神经细胞瘤中过度表达。既然ADAMs家族基因已经被报道在动物模型和癌症患者中肿瘤的形成、侵袭和转移中占有重要的一席之地。设想我们敲除ADAMs家族基因将会抑制肿瘤信息的复制与传递,由此这类基因将会成为癌症治疗不错的新靶标。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)诱发同源基因的表达沉默,该技术因其高效且特异的靶基因抑制而在基因肿瘤功能研究以及肿瘤等疾病的基因治疗中显示出巨大的潜在应用价值,尤其是小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)[8]。在较早的哺乳动物实验中,siRNA是通过化学合成法合成的,但它虽可高效特异性地抑制外源性和内源性基因的表达,但同时存在操作费时费力,价格昂贵,抑制效果维持时间短等缺点。为了能够在哺乳动物中高效、持续表达siRNA,克服上述困难,拓展RNAi技术的应用。使用质粒DNA构建的shRNA表达载体,可以在细胞内生成小干扰性RNA,抑制目的基因的表达,使得哺乳动物细胞内基因表达长期沉默成为可能[9,10]。本研究以ADAM17,ADAM10和PC7基因为研究重点,采用小发夹结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的RNA干扰技术和转基因技术,来探讨ADAMs与肿瘤的密切关系,即抑制该基因的表达可能对肿瘤细胞的生物学效应会有重要的影响。通过研究其对肿瘤细胞的发生发展所发挥的干扰作用,以阐明其在基因治疗中的潜在意义,从而为研究这些特定基因在肿瘤治疗中的机制奠定了基础,同时也为探索基因治疗对抗肿瘤的新策略、新靶点提供了一定的理论基础和实验依据。第一部分RNAi沉默ADAM17基因对多种肿瘤细胞增殖和凋亡的影响目的:探讨RNA干扰技术沉默ADAM17基因表达在肿瘤细胞增殖和凋亡中的影响,以其为研究靶标,为对抗肿瘤的基因治疗提供潜在的依据和手段。方法:采用小发夹结构RNA ( shRNA)介导的RNA干扰技术,利用本实验室已构建好的ADAM17干扰载体pGensil-1-TACE,用脂质体介导重组真核干扰载体转染四株肿瘤细胞(Hela,HepG2,SGC-7901,MCF-7),建立瞬时转录系统,观察转染后绿色荧光蛋白EGFP的表达情况评估转染效率。培养一周并观察其对肿瘤细胞生长状态的影响,采用Annexin-V-PI双染法流式细胞术(FACS)检测转染重组干扰质粒后细胞的凋亡状况。MTT比色法测定细胞增殖的抑制,观察转染前后各组肿瘤细胞增殖能力的变化。结果:干扰真核表达载体成功转入四株肿瘤细胞,荧光显微镜观察其转染效率,其在24h时转染率高达80%。MTT检测显示,沉默细胞增殖能力与阴性质粒对照组和空白对照组相比显著降低(P<0.01或0.05);细胞凋亡百分率在48h时shRNA干扰组(43.68±0.62%)明显高于阴性质粒对照组(21.56±0.96)%和空白对照组(20.66±0.70)%,差异有统计学意义(P<0.01)。可见ADAM17基因沉默后,各组肿瘤细胞增殖能力明显降低并诱导凋亡。结论:ADAM17基因沉默对肿瘤细胞的增殖和凋亡均产生了一定的影响。即有效地抑制了肿瘤细胞的增殖,促进其凋亡。从而为研制和开发肿瘤基因治疗的药物和途径开辟了新思路。第二部分小分子RNA干扰片段阻遏小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中ADAM10及其前体蛋白酶PC7基因的表达目的:探讨靶向ADAM10及其前体蛋白酶PC7基因的短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对N2a细胞中目的基因的沉默效应,即是否能抑制靶基因在哺乳动物肿瘤细胞中目的基因的表达,为进一步利用RNA干扰技术对抗肿瘤的基因治疗提供新的依据和手段。方法:利用DNA重组技术针对ADAM10和PC7基因的shRNA序列克隆到pGensil-1中,构建shRNA真核表达载体,通过酶切和测序等方法进行鉴定。用脂质体介导法将已构建好的重组干扰质粒转染入小鼠神经母细胞瘤N2a细胞株,免疫荧光检测转染效率,采用半定量RT-PCR和Western免疫印迹法分别从mRNA和蛋白质水平检测转染前后目的基因的表达,以及小鼠脑内注射重组干扰质粒pGensil-1-PC7后,在体观察局部转染后绿色荧光的表达,以了解RNA干扰效果。结果:成功构建了真核干扰载体pGensil-1-ADAM10,pGensil-1-PC7;免疫荧光结果显示外源性干扰质粒在神经母细胞瘤N2a细胞中获得瞬时表达,基因转染和表达率可达90%;两目的基因mRNA相对水平(与内参的灰度比值):空白对照组分别为1.35±0.09、1.39±0. 05,阴性对照转染组分别为1. 25±0. 07、1. 27±0. 08,shRNA重组质粒转染组分别为0. 35±0. 03、0. 62±0. 05,可见shRNA重组质粒转染组较其他两组明显降低(P<0.01)。细胞中目的基因的蛋白水平变化趋势与mRNA表达相似。灰度扫描曝光检测显示实验组重组干扰质粒成功转染入小鼠体内有较强绿色荧光的表达,与对照组具有显著差异性。结论:我们构建的shRNA干扰载体能有效沉默小鼠N2a细胞中靶基因的转录和表达,从而可能抑制肿瘤细胞的增殖促其凋亡,为下一步在动物体内利用重组干扰质粒沉默目的基因的表达提供实验基础。综上所述,研究证实应用短发夹状RNA介导的干扰技术对肿瘤细胞可以取得明显干涉效果,进一步完善RNA干扰实验来抑制肿瘤细胞生长是存在可能的。由于ADAM家族基因(ADAM17,ADAM10,PC7)在肿瘤细胞中可能均具有显著的抑制效应,但作用机制尚不明确。因此将有可能成为肿瘤治疗潜在的分子靶点,为进一步进行相关的实验研究打下基础。