论文部分内容阅读
研究目的:骨质疏松是一种代谢性的骨疾病,被认为主是要由破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成之间失衡所致,而成骨细胞实际上主要由骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)分化而来。随着机制研究的逐步深入,发现骨形成与骨血管生成在骨代谢过程中关系密切、互相偶联。因此,骨血管生成能力降低可能也是骨质疏松的发生机制之一。大量研究证实运动能够有效防治骨质疏松,且我们前期的研究初步显示,运动可以上调小鼠下肢骨中lncRNA HOXA11-AS的表达,但运动能否介导lncRNA HOXA11-AS来促进骨形成并提高骨血管生成能力尚不清楚。本研究通过分别对小鼠、小鼠BMSCs进行跑台运动干预和机械牵张应力刺激,并抑制BMSCs中lncRNA HOXA11-AS的表达,收集BMSCs牵张和低表达lncRNA HOXA11-AS后的上清液用于培养SVEC,探究运动及其产生的机械应力是否可以介导lncRNA HOXA11-AS促进骨形成和骨血管生成,进而为运动防治骨质疏松提供理论依据。研究方法:1动物实验部分选取12周龄的雌性C57BL/6小鼠共40只构建去卵巢骨质疏松小鼠模型,随机等分为假手术组和去卵巢组,再按是否进行运动干预分为假手术安静(SHAM)组、假手术运动(SHAM+E)组、去卵巢安静(OVX)组和去卵巢运动(OVX+E)组,每组各10只。去卵巢手术结束后休息2周,运动组小鼠先进行为期1周的适应性跑台运动训练(周一至周五训练,1次/d,30min/次,速度为6m/min,隔天增加2m/min,坡度为25°,周末休息);然后进行为期8周的正式跑台运动训练(周一至周五训练,1次/d,1h/次,包括5min热身运动和55分钟正式运动,起始速度为8m/min,每周递增1m/min,正式运动速度为15m/min,坡度为25°,周末休息)。SHAM组和OVX组小鼠静置饲养,不进行任何干预。跑台运动训练结束后第二天取材,每组随机选5只小鼠,取右侧股骨固定用于micro CT扫描重建分析骨微结构,取右侧胫骨提取总RNA用于Real-time PCR检测lncRNA HOXA11-AS、成骨因子和血管生成因子的表达情况;另5只注射血管造影剂,隔夜取右侧胫骨固定并脱钙处理后用于micro CT扫描重建分析骨血管。2细胞实验部分2.1小鼠原代骨髓间充质干细胞成骨分化实验将培养至第二代的BMSCs接种于六孔细胞培养板上,分为Ctrl和Day7进行7天成骨分化实验,Day7组在成骨诱导培养基中诱导分化7天,Ctrl组不诱导。诱导结束后进行ALP染色检测成骨分化情况。同时,按Ctrl、Day3、Day7、Day14、Day21分组,分别在成骨诱导培养基中诱导分化0、3、7、14和21天,诱导结束后进行茜素红染色及提取RNA。2.2小鼠原代骨髓间充质干细胞机械牵张方案将培养至第二代的BMSCs接种于Bio Flex六孔板中,分为Ctrl、S1、S3、S5、S7共5组。待细胞汇合至80%左右采用Flexcell FX-5000细胞应力加载系统对BMSCs进行7天的机械牵张应力干预(牵张强度为3%、频率为0.5Hz,牵张时长为4h/d,隔天牵张),每48h换液,Ctrl组不进行干预。牵张干预结束后收集上清液用于培养SVEC进行划痕实验,并提取细胞RNA,Real-time PCR检测lncRNA HOXA11-AS、成骨因子和血管生成因子的m RNA表达情况。2.3小鼠原代骨髓间充质干细胞转染实验及转染后上清液干预SVEC实验将培养至第二代的BMSCs接种于细胞培养板中,分为BLANK组、sh-NC组和sh-HOXA11-AS组,待细胞贴壁后并汇合70%时更换为不含血清、青霉素和链霉素的α-MEM基本培养基培养12h,将制备好的sh RNA质粒(sh-HOXA11-AS、sh-NC)-脂质体复合物加入对应孔中,轻摇混匀放至细胞培养箱,BLANK组仅有脂质体、不含sh RNA质粒。6-8h后更换为成骨诱导分化培养基,后面每2-3天更换培养液,7天后终止,收集上清液,并进行ALP染色和提取RNA,Real-time PCR检测lncRNA HOXA11-AS表达情况。另外,通过CCK8检测转染后8h、24h和48h的细胞增殖情况。后续将转染后收集的上清液培养SVEC进行划痕实验,观察SVEC细胞增殖、迁移情况。研究结果:1动物实验部分(1)小鼠股骨microCT结果显示:与SHAM组相比,OVX组小鼠的BV/TV、Ct.Ar/Tt.Ar、Tb.N和Tb.Th明显降低(P<0.01),而Tb.Sp显著升高(P<0.01);SHAM+E组与SHAM组相比,Tb.N显著升高(P<0.05),BMD、BV/TV、Ct.Ar/Tt.Ar及Tb.Th均升高但无统计学差异(P>0.05),且Tb.Sp显著降低(P<0.05);OVX+E组与OVX组相比,BV/TV、Ct.Ar/Tt.Ar和Tb.Th显著上升(P<0.05),Tb.N显著上升(P<0.01),且Tb.Sp显著降低(P<0.01)。(2)小鼠胫骨骨血管micro CT结果显示:与SHAM组相比,OVX组小鼠的骨血管面积显著降低(P<0.05);OXV+E组与OVX组相比骨血管面积显著增加(P<0.05),SHAM+E组与SHAM组相比,骨血管面积增加但无统计学差异(P>0.05)。(3)小鼠胫骨PCR结果显示:与SHAM组相比,OVX组小鼠下肢骨lncRNA HOXA11-AS的显著降低(P<0.01);SHAM+E组小鼠下肢骨lncRNA HOXA11-AS的表达上调但无统计学差异(P>0.05),而OVX+E组小鼠下肢骨lncRNA HOXA11-AS的表达与OVX组相比显著上调(P<0.05)。另外,OVX组小鼠下肢骨中的Osterix、OPN、FGF2等成骨因子和血管生成因子的m RNA表达显著低于SHAM组(P<0.05),而OVX+E组中以上因子表达显著上调(P<0.05)。SHAM+E组与SHAM组相比,Osterix、FGF2、EGFL6表达有升高趋势但无统计学差异(P>0.05),OPN和FGFR1表达显著升高(P<0.01,P<0.05)。2细胞实验部分(1)BMSCs成骨分化实验结果显示:7天成骨分化过程中,ALP染色逐渐加深;21天成骨分化过程中,茜素红染色逐渐加深、钙结节面积逐渐增加;Realtime PCR结果表明:lncRNA-HOXA11-AS的表达逐渐上调,在分化第7天时出现显著性上调(P<0.01),14天时达到峰值,随后表达降低。成骨因子OPN以及血管生成因子FGF2的表达在成骨分化过程均逐步上调,在第7天时显著上调(P<0.01)。(2)BMSCs7天牵张实验结果显示:与Ctrl组相比,所有牵张组细胞的lncRNA HOXA11-AS表达均升高,并且在牵张1天时出现显著性上调(P<0.05),牵张3天时达到峰值(P<0.01),随后表达降低;成骨因子Runx2、ATF4的m RNA表达趋势同lncRNA HOXA11-AS;OPN的m RNA表达则在牵张第3天和第7天表达上调(P<0.01),FGF2的的m RNA表达在牵张1天时表达显著上调(P<0.05),随后表达略微降低但仍高于对照组。划痕实验结果显示:7天机械牵张后的BMSCs上清液逐渐促进SVEC划痕的愈合,但无统计学差异(P>0.05)。(3)BMSCs转染实验结果显示:sh-HOXA11-AS组与sh-NC组相比,在转染第8h和24h时BMSCs增殖未受到明显抑制(P>0.05),而48h时显著抑制BMSCs增殖(P<0.01);划痕实验结果示:BMSCs转染后的上清液培养SVEC细胞24h后,sh-HOXA11-AS组的BMSCs上清液所培养的SVEC细胞,其划痕愈合速度显著低于sh-NC组(P<0.05)。研究结论:运动能有效促进去卵巢骨质疏松小鼠下肢骨中lncRNA HOXA11-AS的表达并促进骨形成和骨血管生成;适宜的机械牵张应力刺激可以促进BMSCs中lncRNA HOXA11-AS的表达并上调成骨因子、血管生成因子的表达,而在BMSCs中低表达lncRNA HOXA11-AS使BMSCs增殖、成骨分化能力以及血管生成能力均受到抑制。