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研究背景及目的乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)感染,是造成慢性肝脏疾病的重要原因之一。全球因乙肝病毒感染死亡的病例中,大部分是由于乙型肝炎导致的肝硬化和肝癌。HBV感染目前依然是全球重要的公共卫生问题。乙肝病毒可以通过母婴传播从孕妇传染至胎儿或新生儿。即使目前已有阻断剂来阻断母婴传播,仍有1%-9%的新生儿会通过这种途径(尤其是宫内感染)感染病毒,同时这些新生儿因体内免疫系统功能发育尚未完全,不能自动清除病毒而转化为慢性感染,这可能对其生长发育,尤其是肝功能,造成严重影响。大多数研究表明,DNA甲基化可能介导了产前这一重要时期孕妇的不良暴露(如吸烟、抑郁等)与新生儿发育之间的关联。产前HBV感染与新生儿的生长发育状态有关,然而在未对出生结局造成影响的前提下,产前HBV感染与胎儿脐带血DNA甲基化变化的关联尚未可知。本研究结合流行病学和生物信息学的方法,开展产前乙肝病毒感染与胎儿脐带血DNA甲基化的关联性分析。研究方法采用巢式病例对照的研究方法,我们在前期于厦门市莲花医院建立了含有1064对母婴的队列,其中共有179例孕妇感染HBV,34例孕妇的胎儿亦感染HBV。本研究分为两个阶段:(1)从队列中随机选择12例产前孕妇/胎儿均感染HBV 的研究对象(infected newborns with infected mother,INIM 组),并根据匹配的原则选择12例健康对照(healthy controls,HC组)共24例作为探索样本。利用Infinium Human Methylation 450 BeadChip Kit检测探索样本中胎儿脐带血全基因组DNA甲基化水平,分析芯片检测结果,筛选差异甲基化位点。(2)在验证阶段增加一组产前孕妇感染HBV而胎儿未感染HBV的研究对象(non-infected newborns with infected mother,NNIM组),以分析脐带血DNA甲基化是否仅仅会因孕妇产前感染HBV而变化。排除探索样本中已检测的、孕期发生妊娠并发症或在分娩时出现不良出生结局的研究对象后,从队列中共收集21例INIM、49例NNIM以及和二者相匹配的50例HC作为验证样本。利用焦磷酸测序检测验证样本中验证基因位点的甲基化水平以对全基因组甲基化结果进行验证,并通过荧光定量PCR技术检测脐带血中验证基因的mRNA表达量。研究结果(1)产前孕妇感染乙肝且胎儿亦感染组(1NIM)和健康对照组(HC)在全基因组水平上的平均甲基化率无差异,但两组间依然存在663个甲基化水平和产前HBV感染相关的CpG位点,其中46.15%(306/663)的位点在INIM组的甲基化率升高,53.85%(357/663)的位点甲基化率降低,这些位点位于534个基因上。通过基因功能分析可知,这些基因主要涉及细胞内物质组成、胞内代谢和基因表达等生物过程。(2)全基因组甲基化结果中,KLHL35和CPT1B基因含有较多差异甲基化位点,并且这两个基因的DNA甲基化分别与肝细胞癌和脂肪酸氧化代谢过程有关。焦磷酸测序检测两个基因上的差异甲基化位点结果显示,cg05353869、cg06329735(位于KLHL35)和cg10770023(位于CPT1B)的焦磷酸测序结果和450K芯片检测结果间具有较强的关联性(cg05353869:rs=0.948,p<0.001;cg06329735:rs=0.937,p<0.001;cg10770023:rs=0.958,p<0.001),表明两种检测方法的结果一致性较好。(3)利用稳健回归模型排除其他潜在的影响因素后,cg05353869和cg06329735(位于KLHL35)在INIM组的甲基化率仍高于HC组(cg05353869:β=2.01,调整 p 值=0.016;cg06329735:β=1.46,调整 p 值=0.016),在 NNIM 组与HC组的甲基化率之间无差异。而这种甲基化差异并未表现在KLHL35基因转录水平上(INIM vs NNIM vs HC:0.21 vs 0.20 vs 0.18,p=0.132)。位于 CPT1B 基因上的cg10770023的甲基化率升高与孕妇产前HBV感染有关(无论胎儿是否受宫内感染)(INIMvs HC:β=1.03,调整 p 值=0.032;NNIMvsHC:β=0.87,调整 p 值=0.003),且与对照组相比,该基因的转录水平也相应下降(INIM vsHC:0.17vs 0.22,调整 p 值=0.001;NNIM vsHC:0.17 vs 0.22,调整 p 值=0.016)。结论产前乙肝病毒感染可能会改变新生儿脐带血DNA甲基化水平。在本研究中,我们在全基因组水平上共发现663个位点的甲基化率变化和产前HBV感染有关,并通过扩大研究样本量验证了KLHL35和CPT1B基因上的位点甲基化和产前HBV暴露的关联性,表明脐带血DNA甲基化可能是反映产前乙肝病毒暴露的一种生物标志。对于产前HBV感染、DNA甲基化和新生儿健康状况之间的关联,我们还需要通过大型的人群队列,经过长期的随访观察才能准确阐明三者的关系,从分子机制推测产前乙肝病毒感染与出生后相关疾病发生之间的关系,同时也可为依托大型出生队列而开展的纵向研究提供支持与补充。