随着科学技术的发展,荧光共振能量转移技术在生化分析和临床诊断中有着越来越广泛的应用。基于能量转移技术的核酸探针以核苷酸序列作为基本骨架,以碱基互补配对或其他相互作用方式作为识别机制,根据供体和受体间能量转移成功实现与否产生光信号或者电信号变化,将探针和靶物之间的作用体现出来。目前基于能量转移的核酸探针已经成功应用于检测生物小分子、蛋白质、核酸以及多种疾病标志物。然而,传统的能量转移荧光探针多采用单供体-单受体能量转移对。在仅有单个供体存在能量转移体系中,受能量转移效率的限制,供体荧光不能被完全猝灭,整个探针体系存在较高的背景信号和较低的信噪比,从而影响检测的灵敏度和准确性。为了解决这个问题,本论文通过构建单供体-多受体能量转移体系,结合核酸三螺旋结构,双核酸催化组装(catalyzed hairpin assembly,CHA)信号放大技术等构建了一系列通用型的低背景信号能量转移探针,实现了DNA,microRNA的灵敏检测,并将其进一步拓展应用到癌症的早期诊断中。本论文主要展开了以下两个工作:(1)设计了一种基于能量转移的单供体-四受体三螺旋核酸探针,并成功实现了丙型肝炎病毒DNA的灵敏检测。本设计以核苷酸序列为基本骨架,在核酸序列两端修饰相应的供体和受体,并在合适条件下孵育,核酸序列间通过Waston-Crick氢键碱基配对和Hoogsteen氢键互补配对形成单供体-四受体的三螺旋核酸探针。当靶物不存在的时候,形成的三螺旋结构拉近供受体间的距离,能量转移发生,供体荧光猝灭。靶物存在时,其和探针的识别序列结合,促使三螺旋结构解体,标记在核酸序列上的供受体距离也随之增大,能量转移过程受阻,供体的荧光得以恢复。该方法通过增加供体的数量而显著提高了供受体间的能量转移效率,极大地降低了荧光探针在检测过程中的背景信号,提高了检测体系的灵敏度和选择性。(2)设计了一个无酶信号放大的单供体-多受体能量转移核酸探针用于microRNA-21的灵敏检测。该方案进一步引入双核酸催化组装(catalyzed hairpin assembly,CHA)信号放大技术,显著放大了探针在检测时产生的响应信号,极大降低了反应的检测限,提高了检测的灵敏度,并成功将该方法运用于microRNA-21的灵敏检测。该方法以核酸序列作为靶物的识别单元,与传统的microRNA-21检测方法相比,具有快捷、操作简单、经济实惠、检测限低等优点。同时,通过引入CHA技术进行反应信号循环放大,进一步提高了检测的灵敏度。在此设计中,标记有能量受体染料且含有microRNA-21识别序列的核苷酸链通过和标记有供体染料的另一段核苷酸序列互补配对,形成一个单供体-二受体的能量转移探针。由于供受体间能量转移的存在,探针表现出受体的荧光信号。当加入microRNA-21时,其与探针的识别序列结合,使得三螺旋结构解体,供受体间的能量转移受阻,供体的荧光恢复。同时,靶物和探针形成的双螺旋结构又能和发卡结构H1反应,置换出microRNA-21,与其他三螺旋探针反应,从而实现CHA循环,实现信号放大。即便加入少量的microRNA-21也可以通过此循环和大量的核酸探针进行反应,产生明显的荧光信号,从而实现microRNA-21的灵敏检测。此外,这还是一个通用型的检测方法,通过改变识别序列的种类便可实现不同靶物的灵敏检测。综上所述,在本研究中,我们设计了低背景信号、高选择性的单供体-多受体能量转移探针检测方法,该方法已经成功应用到疾病标志物(丙型肝炎病毒DNA,microRNA-21)的分析检测中。同时,通过结合信号放大方法,进一步提高了能量转移探针检测方法的灵敏度和选择性,为疾病的早期诊断和治疗提供了简洁迅速的方法。此外,这些方法还具有通用性,只要更换不同的核酸识别序列,便可进行其他靶物的分析检测。