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目的:在脊髓星形胶质细胞受到损伤活化为反应性星形胶质细胞后,探讨亚低温和过表达Neuro D1对脊髓反应性星形胶质细胞的影响。方法:1体外培养原代新生SD大鼠脊髓星形胶质细胞:从新生1~3 d SD大鼠脊髓组织中提取并纯化星形胶质细胞,通过免疫荧光及流式细胞仪检测星形胶质细胞纯度,用于制备反应性星形胶质细胞(Reactive Astrocytes,RAS)。2划痕实验制备RAS:利用10μl无菌加样枪头在培养板中沿“井”字样划痕,控制统一的力度和速度。划痕损伤后,更换培养基,并利用免疫荧光检测RAS纯度。3亚低温对划痕损伤后RAS的影响:试验细胞分为4组:对照组、划痕组、亚低温组和划痕+亚低温组。其中对照组细胞为未经划痕损伤并置于37℃培养箱中培养,划痕组细胞行划痕实验并置于37℃培养箱中培养,亚低温组细胞未经划痕损伤并置于33℃培养箱中培养,划痕+亚低温组细胞行划痕实验并置于33℃培养箱中培养。各组细胞在相应的时间点观察细胞形态,利用免疫荧光染色方法检测Nestin阳性率,MTT比色法检测细胞活性,PI染色方法检测细胞凋亡程度。4牵张实验制备RAS:牵张损伤实验装置由Bioflex细胞培养板、CICⅡ型细胞损伤仪、高纯氮气组成。调整计量阀门压力为12 PSI(Pounds per square inch),打击后峰值为3 PSI。牵张损伤后,更换培养基,并利用免疫荧光检测RAS纯度。5亚低温对牵张损伤后RAS的影响:试验细胞分为4组:对照组、牵张组、亚低温组和牵张+亚低温组。其中对照组细胞为未经牵张损伤并置于37℃培养箱中培养,牵张组细胞行牵张实验并置于37℃培养箱中培养,亚低温组细胞未经牵张损伤并置于33℃培养箱中培养,牵张+亚低温组细胞行牵张实验并置于33℃培养箱中培养。各组细胞在相应的时间点观察细胞形态,利用MTT比色法检测细胞活性,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量检测细胞损伤程度。6过表达Neuro D1对划痕后RAS的影响:试验分为3组:空白组(NV组)、对照病毒组(GFP组)和Neuro D1病毒组(Neuro D1组)。各组细胞行划痕实验后,NV组细胞不接受病毒感染,携带GFP基因的逆转录病毒感染GFP组细胞,同时携带GFP和Neuro D1基因的逆转录病毒感染Neuro D1组细胞,24 h后同时更换神经元条件培养基。各组细胞在相应时间点观察细胞形态变化,并在感染病毒后7 d和14 d分别利用免疫荧光染色方法检测细胞DCX阳性率和检测细胞Neu N阳性率。结果:1原代脊髓星形胶质细胞的纯度检测:利用GFAP免疫荧光检测第3次传代后,星形胶质细胞的GFAP阳性率达到95%以上。利用流式细胞仪检测纯度可达到93.94%。2划痕损伤和牵张损伤后RAS纯度检测:利用Nestin/GFAP免疫荧光双染检测划痕损伤和牵张损伤后RAS纯度,RAS纯度可以用Nestin阳性率表示,划痕损伤和牵张损伤后RAS的Nestin阳性率都在80%以上。3光学显微镜观察划痕损伤后细胞形态改变:细胞受到划痕损伤后,细胞胞体变得肥大,周围的突起开始增多并逐渐延展,细胞的胞浆变得丰富。处于亚低温环境的细胞,变化相比减慢,周围突起增多不明显,并且细胞逐渐深入划痕处所需要的时间增加。4光学显微镜观察牵张损伤后细胞形态改变:细胞受到牵张损伤后,星形胶质细胞活化为反应性星形胶质细胞,细胞胞体肿大,细胞周围突起及连接多处断裂,并且细胞开始活化增生。处于亚低温环境的细胞,细胞变化不明显,断裂处恢复所需时间减少。5划痕损伤后检测各组细胞Nestin阳性率来反应损伤后的活化程度:与对照组和亚低温组相比,划痕组和划痕+亚低温组明显升高,说明划痕损伤引起星形胶质细胞活化,且具有统计学意义(P<0.01)。与划痕组相比,划痕+亚低温组又较低,说明亚低温可以抑制星形胶质细胞活化,且具有统计学意义(P<0.01)。6划痕损伤后检测各组细胞PI阳性率来反应损伤后的凋亡程度:与划痕组和划痕+亚低温组相比,对照组和亚低温组PI阳性率降低,说明划痕造成细胞凋亡,具有统计学意义(P<0.01)。与划痕组相比,划痕+亚低温组PI阳性率降低,表明亚低温可以抑制星形胶质细胞凋亡,具有统计学意义(P<0.01)。7划痕损伤后检测各组细胞MTT值来反应损伤后的生长率:与划痕组和划痕+亚低温组相比,对照组和亚低温组生长率在第3 d后明显下降,说明划痕引起细胞增生。与划痕组相比,划痕+亚低温组各时间点生长率明显降低,表明亚低温可以抑制细胞活化增生。且具有统计学意义(P<0.01)。8牵张损伤后检测各组细胞MTT值来反应损伤后的生长率:在损伤后的3 d或5 d,损伤组与对照组相比、损伤+亚低温组与亚低温组相比较,都是前者大于后者,表明牵张损伤后会导致RAS的增生。损伤组与损伤+亚低温组相比较,在损伤后3 d,前者增长速率大于后者,表明亚低温可以抑制RAS的增生。且都具有统计学意义(P<0.01)。9牵张损伤后检测各组细胞LDH值来反应细胞的损伤程度:在损伤后1 d,损伤组与对照组相比、损伤+亚低温组与亚低温组相比较,表明牵张损伤后会RAS受到损伤,并且在损伤后的2 d,损伤组的LDH释放率大于1 d时的值,表明损伤组RAS进一步损伤。损伤组与损伤+亚低温组相比较,在损伤后2 d,前者LDH释放率大于后者,表明亚低温可以抑制RAS的损伤程度。且都具有统计学意义(P<0.01)。10光学显微镜观察逆转录病毒感染细胞后形态改变:在病毒感染后的7 d内,各组细胞发生形态改变,胞核饱满明显,胞浆变得减少,周围突起逐渐减少并延长。与Neuro D1组细胞相比,NV组和GFP组周围突起短而分枝多,胞核变化不明显。感染7 d后,NV组和GFP组细胞形态逐渐恢复到以前形态,而Neuro D1组细胞维持当前形态。11逆转录病毒感染细胞7 d后DCX阳性率:与NV组和GFP组的阳性率相比,Neuro D1组细胞的DCX阳性率增加明显,且具有统计学意义(P<0.01)。12逆转录病毒感染细胞14 d后Neu N阳性率:与NV组和GFP组的阳性率相比,Neuro D1组细胞的Neu N阳性率增加明显,且具有统计学意义(P<0.01)。结论:1划痕损伤后星形胶质细胞活化为RAS并会增生,亚低温明显抑制脊髓RAS的活化增生,并可以抑制RAS的凋亡。2牵张损伤后RAS突起及细胞连接处会发生断裂,损伤后细胞增生明显。亚低温可明显抑制RAS的活化增生,同时可以抑制细胞的进一步损伤。3细胞在体外培养中,Neuro D1的过表达可以介导脊髓RAS转分化为神经元样细胞。