论文部分内容阅读
毒液（Venom）作为寄生蜂与寄主协同进化的产物,具有调控寄主的免疫、发育、营养代谢等功能,在寄生蜂调控寄主中发挥重要作用。目前,尽管已有部分寄生蜂的毒液成分得到揭示,但主要局限在姬蜂科Ichneumonidae、茧蜂科Braconidae、金小蜂科Pteromalidae等少数类群中,且仅明确少数寄生蜂毒液蛋白的功能及作用机制。有鉴于此,本论文以管氏肿腿蜂Scleroderma guani（Hymenoptera:Bethylidae）为研究对象,对该蜂毒液蛋白以及其中的1个丝氨酸蛋白酶同源物（Serine protease homology,SPH）基因（SgSPH72）的功能进行了研究。主要研究结果如下:1.管氏肿腿蜂毒液基因鉴定与表达谱分析联合蛋白质组和转录组学技术,鉴定得到102个管氏肿腿蜂毒液基因。其中,转录组和蛋白质组共有26个,转录组特有74个,蛋白质组特有2个。除16个毒液蛋白为未知功能的新蛋白外,其余毒液蛋白可分为11个功能类别,数量最多的是酶类,且酶类中以丝氨酸蛋白酶（Serine proteases,SPs）及其同源物SPHs数量最多,共有10个。基于基因数字表达谱技术分析发现,管氏肿腿蜂毒液基因在不同发育阶段和不同组织中均有不同程度的表达,其中55个毒液基因在毒液器官及雌成虫阶段呈现特异性或高表达。2.管氏肿腿蜂SPs/SPHs基因鉴定及表达特征分析基于Blast同源比对的方法,从管氏肿腿蜂基因组中鉴定到78个SPs/SPHs基因。它们可为单结构域、Clip结构域和多结构域三类。分子进化树和基因Scaffold定位分析结果表明,部分管氏肿腿蜂单结构域SPs/SPHs基因及毒液SPs/SPHs基因存在基因复制现象。基于基因数字表达谱技术分析发现,部分单结构域SPs/SPHs基因在消化道及幼虫阶段表达最高,应与消化功能有关;部分在雌成虫阶段高表达的SPs/SPHs在毒液器官中特异性表达或高表达。通过对比分析SPs/SPHs基因在非毒液与毒液组织之间的表达特征,鉴定到10个毒液SPs/SPHs基因。这些毒液SPs/SPHs基因在毒液器官和雌成虫中高表达,其中8个特异性高表达,而非毒液SPs/SPHs均不在毒液器官高表达。实时荧光定量PCR（Quantitative fluorescence real-time PCR,q PCR）验证表明,鉴定到的10个管氏肿腿蜂毒液SPs/SPHs基因在毒液器官中显著性高表达。综合现有寄生蜂毒液SPs/SPHs以及论文研究结果发现,SgSPH72为功能尚待揭示的寄生蜂毒液高分子量SPH。3.管氏肿腿蜂毒液SgSPH72对寄主海藻糖代谢通路基因的调控通过转录组学技术,比对分析注射SgSPH72 24 h后寄主黄粉甲Tenebrio molitor蛹基因的差异表达情况,发现共有593个基因发生差异表达,303个基因的表达上调,290个基因的表达下调。在最上调的寄主基因中,包括海藻糖酶（Trehalase,TRE）基因。进一步采用q PCR技术分析发现,SgSPH72还能对海藻糖代谢通路中的海藻糖合成酶TPS（Trehalose-6-phosphate synthase,TPS）、糖原合成酶GS（Glycogen synthase,GS）及糖原磷酸化酶GP（Glycogen phosphorylase,GP）基因的表达产生不同程度的影响。这些结果表明,管氏肿腿蜂毒液SgSPH72能够调控寄主黄粉甲蛹海藻糖代谢通路基因的表达,进而调控寄主的糖类代谢。4.管氏肿腿蜂毒液SgSPH72对寄主糖类代谢的影响通过蒽酮法和3,5-二硝基水杨酸比色法,测定注射毒液SgSPH72 6 h和24 h后寄主黄粉甲蛹血淋巴和脂肪体中的糖类含量变化情况发现,注射毒液SgSPH72 6h后,黄粉甲蛹血淋巴和脂肪体中总糖、糖原、还原糖和海藻糖的含量均显著高于对照组。注射毒液SgSPH72 24 h后,黄粉甲蛹血淋巴和脂肪体中糖原和还原糖含量升高,血淋巴中总糖和海藻糖含量无明显变化,脂肪体中总糖和海藻糖含量无显著变化。本研究揭示了管氏肿腿蜂毒液蛋白成分,明确了毒液基因在不同发育阶段和不同组织的表达模式,发现高丰度毒液SgSPH72可通过调控寄主海藻糖代谢通路进而影响其糖类代谢。本研究为今后深入研究管氏肿腿蜂毒液蛋白功能以及寄生蜂毒液基因的进化奠定了基础,鉴定到了多个新的寄生蜂毒液蛋白,首次阐明了寄生蜂毒液蛋白调控寄主糖类代谢的机制,增添了对寄生蜂与寄主互作机制的新认知。