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胃癌相关基因GCRG213是由本实验室应用荧光标记的mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术筛选出一条在肠型胃癌组织、癌旁和正常组织间差异表达的新基因,生物信息学分析表明它具有完整的开放阅读框架,编码含有142个氨基酸的产物。原位杂交和Nortbern blot显示该基因在胃癌和癌旁不典型增生组织的表达高于正常胃组织。同源比对,该基因与机体中碱基切除修复的关键酶APE/Ref-1序列有61%同源性并且含有其保守区的功能位点,可能是APE/Ref-1的一个变异体。APE/Ref-1(apurinic/apyrimidinic endonucleas)即人类无嘌呤无嘧啶核酸内切酶,是修复AP位点的关健酶,它还有调节参与细胞增殖、分化的转录因子活性的作用。近年来研究表明,APE/Ref-1与肿瘤的发生发展关系密切,其表达在前列腺、卵巢、子宫、结肠、生殖细胞等多种恶性肿瘤中明显增高,且可以协助判断一些肿瘤的预后。因此明确胃癌相关基因GCRG213的功能,对胃癌的发病机制、诊断治疗及预后判断将提供新的思路和手段。 目的:研究胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位及其正义、反义、siRNA转染对胃癌细胞MKN45的影响 方法: 1、采用PCR技术,从pGEM-T质粒上选择性扩增出包含完整ORF在内的人胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,将目的片段两端分别引入限制性内切酶PstI和BamHI识别位点,克隆至真核表达载体pEGFP-N1。 2、将测序正确的阳性重组子pEGFP-N1-GCRG213采用脂质体瞬时转染COS-7细胞,激光共聚焦技术检测GCRG213基因在真核细胞内的蛋白定位。 3、将从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,两端分别引入限制性內切酶KpnI、BamHI和EcoRI、BamHI识别位点,按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)。 4、设计两对针对GCRG213可转录为小干扰RNA(siRNA)的DNA片段,