论文部分内容阅读
黄芪是一种常用中药,含有多糖,生物碱,黄酮类,苷类,微量元素等多种生物活性物质,其中黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)是重要的生物活性组分。黄芪多糖具有增强机体免疫功能,强心降压,降血糖,抗应激,抗肿瘤,抗辐射,抗氧化等多种生物活性。由于黄芪多糖具有多种药理功效,多年来关于黄芪多糖的提取纯化及药理功效已成为中草药现代研究的热点之一。巨噬细胞在宿主防御反应中起到重要作用,是天然免疫应答的主要参与者。激活的巨噬细胞能够抑制多种肿瘤细胞和病原微生物的增殖；巨噬细胞可以作为抗原体呈细胞与T细胞相互作用来调节适当的免疫应答。此外,巨噬细胞还参与了胚胎期组织塑形,创伤的修复,凋亡细胞的清除及血细胞的生成。本课题主要分为两部分进行,第一部分是以黄芪饮片为原料经脱脂,水提,除蛋白,梯度醇沉获得粗多糖进行凝胶过滤,采用分布收集获得洗脱液通过凝胶尺寸排阻色谱法(GPC-SEC)进行分析鉴定,根据不同洗脱体积中多糖分子量的差异,选择平均分子量相对均一、得率、纯度较高的APS做为进一步研究的对象。第二部分以小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7为研究对象,应用荧光染料2-氨基吖啶酮(2-AMAC)对APS进行荧光标记,激光共聚焦显微镜观察2-AMAC标记的APS(2-AMAC-APS)与RAW264.7巨噬细胞的的结合。通过Griess法和酶联免疫吸附实验(ELISA),研究APS对巨噬细胞NO及细胞因子TNF-a, GM-CSF生成的影响,多粘菌素B (PMB)能特异性抑制脂多糖(LPS)活性而对APS则没有影响,所以PMB可用来排除LPS对APS的污染。APS制备实验结果显示：100g黄芪经脱脂,90℃水提,浓缩,除蛋白,梯度醇沉后得到粗多糖通过凝胶过滤分布收集,利用GPC-SEC对洗脱液进行组分分析和分子量测定后,根据洗脱液平均分子量的差异,将所得多糖分为三部分,分别进行超滤脱盐,冷冻干燥,获得性状为易溶于水的白色、疏松、絮状APS1466mg,第一部分189mg, MW 2.4×105Da,1.0×105Da,第二部分952mg, MW6.9×104Da,第三部分325mg, MW3.2×104Da,1.6×104Da。由于第二部分多糖分子量范围较均一,糖含量较高(92%)其被作为研究目标进行进一步生物学研究。RAW264.7巨噬细胞对APS的结合实验结果表明,巨噬细胞对2-AMAC-APS的摄取是一个有饱和度的时间依赖过程,而且未标记的APS能竞争性抑制该结合效应,这与巨噬细胞表面相关受体的饱和有关。Griess法测NO及ELISA法测细胞因子实验结果显示,以全细胞培养液孵育的巨噬细胞为阴性对照,以1μg/ml的LPS予以刺激的巨噬细胞为阳性对照组,以0,12.5,25,50,100Hg/ml剂量的APS作用于RAW264.7细胞12小时,50,100μg/mlAPS实验组可明显诱导巨噬细胞NO的生成(P<0.05)。25,50,100μg/mlAPS实验组可促进巨噬细胞TNF-a, GM-CSF的生成,而且呈明显的剂量依赖关系(P<0.05)。PMB与APS联合作用,不影响APS对巨噬细胞的激活作用(P>0.05),表明可以排除APS受LPS污染的可能。本实验表明：采用水提醇沉法结合GPC-SEC可以简单、快速、有效的对APS进行分离纯化,并进行分子量的鉴定。所得的MW 6.9×104Da APS纯度为92%,得率0.95%。APS作用于巨噬细胞可呈剂量依赖性的诱导巨噬细胞NO, TNF-a, GM-CSF生成的增加。