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1.背景与目的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)或急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome)是由炎症失控所致的临床危重症疾病,表现为急性呼吸窘迫,低氧血症和非心源性肺水肿。近年来虽然在气道管理和保护性机械通气策略等方面有了长足的进步,但因为其发病机制尚不完全明确,ARDS患者的死亡率仍然居高不下。由中性粒细胞过度激活导致的氧化应激是参与ARDS肺部炎症损伤发生发展的重要事件。研究证实脂多糖(LPS)不仅能够氧化细胞膜脂质,还能够通过激活NADPH氧化酶产生氧自由基诱导急性肺损伤的发生,因此明确LPS诱导炎症损伤的发病机制对于治疗急性肺损伤具有重要意义。血管生成素样蛋白4(ANGPTL4),又称为禁食诱导的脂肪因子,参与LPS诱导的肝脏以及脂肪组织中的炎症反应。我们前期预实验发现LPS腹腔注射后,小鼠肺组织中Angptl4的表达明显增加,但其在LPS诱导的急性肺损伤中的确切作用尚不明确。鉴于此,本课题拟通过构建带有目的基因干扰片段的慢病毒下调Angptl4在肺内的表达,明确Angptl4在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中的作用;通过构建干扰质粒下调Angptl4在人肺泡上皮细胞株A549细胞的表达,探讨Angptl4调控LPS诱导炎症损伤的可能机制,并为急性肺损伤的防治提供新的作用靶点。2.研究方法(1)ANGPTL4基因RNAi慢病毒载体的构建根据小鼠源性murine ANGPTL4(m ANGPTL4)基因设计si RNA靶点,合成含有ANGPTL4干扰序列的单链DNA oligo,然后退火以及PCR扩增产生双链,经过酶切和连接反应构建GV118-m ANGPTL4 RNAi慢病毒载体,将连接产物转入制备好的大肠杆菌感受态细胞,通过PCR扩增、测序验证以及测序结果比对确认构建含有ANGPTL4小干扰RNA片段(Angptl4-si RNA,简称为Angsi RNA)的RNAi慢病毒载体;利用p Helper1.0以及p Helper2.0辅助载体将Angsi RNA慢病毒载体共转染入293T细胞,收获病毒并利用孔稀释法对慢病毒Angsi RNA的质量和滴度进行测定;建立Angsi RNA体内感染模型,采用免疫组化、荧光定量PCR、Western blot和肺组织病理切片染色等方法,检测Angsi RNA在肺内的干扰效率以及对小鼠肺部病理改变的影响。(2)观察Angptl4的下调表达对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用用经鼻滴注的方法,以4x107PFU/只的剂量建立小鼠慢病毒Angsi RNA感染模型,同时用空病毒载体NCsi RNA作为阴性对照。体内转染48h后,腹腔注射LPS(15mg/kg)以建立急性肺损伤小鼠模型。采用荧光定量PCR、Western blot、免疫组化等方法检测慢病毒Angsi RNA在体内的干扰效率;通过比较中性粒细胞在小鼠肺内浸润程度以及炎症因子表达差异来评估肺部炎症变化情况;采用肺组织湿干比、肺泡灌洗液蛋白浓度等指标来评估通透性改变情况;通过比较cleaved-caspase3在各处理小鼠肺组织的表达差异来评估损伤改变情况;同时通过观察小鼠7天存活率来评估Angptl4的下调表达对LPS诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用。此外,用荧光定量PCR、Western blot方法检测SIRT1和NF-k B表达变化情况;用脂质氧化(MDA)检测各处理小鼠肺组织MDA含量,以探讨Angptl4的下调表达保护LPS诱导的急性肺损伤小鼠的可能机制。(3)以人肺泡上皮细胞株A549细胞为模型探讨Angptl4在LPS诱导的急性肺损伤中的作用机制用Western blot的方法比较A549细胞中,Angptl4在LPS刺激后各个时间点的表达变化;构建质粒,用RNA干扰的方法下调Angptl4在A549细胞中的表达,观察Angptl4对LPS诱导的细胞炎症损伤以及信号通路分子SIRT1表达的影响;采用si RNA干扰技术和SIRT1拮抗剂尼克酰胺(NAM)同时下调Angptl4和SIRT1在A549细胞的表达后,通过观察炎症因子IL6和NF-k B表达变化情况进一步明确SIRT1信号通路在Angptl4调控LPS诱导的急性肺损伤中的作用。3.结果(1)成功构建了具有干扰目的基因作用的Angsi RNA慢病毒和对照空病毒NCsi RNA,感染滴度分别为:1x109 PFU/m L,2x109PFU/m L,符合实验要求;荧光定量PCR、Western blot、免疫组化结果证实慢病毒Angsi RNA经鼻滴入后能够显著下调Angptl4在肺组织中的表达(P<0.05),并且不会引起小鼠肺组织发生明显的病理变化。(2)Angptl4表达于正常小鼠肺组织,主要分布于肺泡上皮细胞。LPS腹腔注射后,小鼠肺内Angptl4表达水平显著增加(P<0.05);与LPS以及NCsi RNA+LPS组相比,Angsi RNA+LPS组小鼠肺组织中性粒细胞浸润减轻、炎症因子TNF-α和IL6含量减少、肺湿干比和肺泡灌洗液蛋白浓度降低、肺内MPO表达降低、活化的caspase3表达降低、肺损伤小鼠7天存活率显著提高(P<0.05)。(3)与LPS以及NCsi RNA+LPS组相比,Angsi RNA+LPS组小鼠肺组织SIRT1表达显著增加(P<0.05);NF-k B表达和MDA表达含量显著降低(P<0.05)。(4)LPS刺激后,Angptl4在A549细胞中表达上调;下调Angptl4的表达能够减轻LPS诱导的炎性因子TNFα和IL6的释放和A549细胞凋亡(P<0.05);与LPS和NCsi RNA+LPS组相比,Angsi RNA+LPS组A549细胞中SIRT1表达增加。为了进一步证实SIRT1信号通路在Angptl4调控LPS诱导的急性肺损伤中的作用,我们同时下调了Angptl4和SIRT1在A549细胞的表达,与Angsi RNA+LPS组相比,Angsi RNA+LPS+NAM组A549细胞中IL6和NF-k B表达显著增加(P<0.05)。4.结论(1)LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺内Angptl4表达上调,下调Angptl4的表达对LPS诱导的急性肺损伤起保护作用;(2)SIRT1信号通路和脂质氧化可能参与了Angptl4对LPS诱导的急性肺损伤的调控作用。