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研究目的本次研究旨在监测我国六个城市碳青霉烯类耐药肠杆菌(Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae,CRE)的流行现状;检测未接受过头孢他啶-阿维巴坦(ceftazidime-avibactam,CAZ-AVI)治疗的产 KPC 型 CRE(KPC-producing CRE,KPC-CRE)对CAZ-AVI的体外敏感性;研究产KPC型肺炎克雷伯菌(KPC-producing Klebsiella pneumoniae,KPC-KP)对CAZ-AVI 的耐药特性。研究方法CRE菌株相关研究:收集2016年10月-2018年6月我国六个不同城市六家三级甲等医院的非重复CRE菌株;使用EPIINFO软件收集菌种信息、药敏信息以及菌株对应患者的临床信息;通过MALDI-TOFMS和16S rRNA测序比对进行菌种的再次鉴定与验证;多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)对菌株进行ST分型;采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)结合Sanger测序,检测CRE中常见碳青霉烯酶基因;采用微量肉汤稀释法测定CAZ-AVI对KPC-CRE的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。CAZ-AVI敏感性降低菌株相关研究:使用Phoenix-100配套药敏板进行药敏分析;多重PCR法检测毒力基因(rmpA,rmpA2,iroN,iutA)及KL分型;脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)结合 GelJ2.0 分析软件分析同源性;PCR结合 Sanger 测序检测超广谱 β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases,ESBLs)基因、外膜蛋白基因、blaKPC全长序列及其启动子区域;以rpoB为内参基因,CAZ-AVI敏感菌株为对照组,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)结合相对定量计算blaKPC拷贝数及表达量;体外CAZ-AVI压力选择实验检测并记录菌株MIC值的变化。压力选择耐药菌株相关研究:检测外膜蛋白基因、blaKPC全长序列以及blaKPC拷贝数和表达量;将菌株连续传200代,检测并记录CAZ-AVI MIC值的变化。统计分析:blKPC拷贝数及表达量、体外压力选择实验以及耐药稳定性实验中菌株MIC值的变化,均使用GraphPad Prism5对进行统计学分析。研究结果1.本次研究共分离临床CRE902株,其中肺炎克雷伯菌616株(68.3%),以ST11为主;大肠埃希菌140株(15.5%),分属于11种ST分型。2.本次研究检测出741株(82.2%)产碳青霉烯酶肠杆菌(carbapenemase-producing Enterobacteriaceae,CPE),其中 410 株(55.3%)携带 blaKPC,320 株(43.2%)携带blaNDM,31株携带blaIMP,9株携带blaVIM,未检测到携带blaOXA-48的菌株;除阿米卡星、妥布霉素和复方新诺明外,CRE对临床常见抗菌药物耐药率均>70%。3.在只携带blaKPC的361株CPE中,CAZ-AVI敏感率为99.7%;筛选出12株CAZ-AVI敏感性降低KPC-KP(MIC ≥4/4μg/ml)。12株菌对大多数临床常用抗菌药物耐药;MLST分型均为ST11型,其中8株为KL64,4株为KL47;其中6株菌携带全部四种毒力基因且PFGE带型相同;12株菌均携带ESBLs基因,且OmpK35缺失,OmpK36功能缺陷;blaKPC拷贝数和表达量分别为敏感菌株的2.6倍和3.9倍。4.当CAZ-AVI体外压力浓度达到4/4 μg/ml时,实验组菌株CAZ-AVI MIC均≥32/4 μg/ml,而对照组菌株 MIC 均 ≤8/4 μg/ml。5.CAZ-AVI压力选择耐药菌株中,1株菌检测到KPC-2 D179Y突变;其余菌株blaKPC-2为野生型,其拷贝数和表达量分别为敏感菌株的2.5倍和3.4倍。6.CAZ-AVI压力选择耐药菌株传200代后,1株菌CAZ-AVI MIC为8/4 μg/ml;其余 6 株 MIC ≥16/4 μg/ml,且其中两株 MIC ≥128/4 μg/ml。研究结论1.六家三级甲等医院CRE以KPC-CRE最为常见,目前临床治疗形式严峻。2.CAZ-AVI对未接受过该药物治疗的KPC-CRE具有很强的体外抑制作用。3.KPC-KP对CAZ-AVI敏感性降低可能与blaKPC拷贝数和/或表达量增加相关。4.敏感性降低KPC-KP更易对CAZ-AVI产生耐药性,且耐药表型较稳定。