松材线虫病是松属树种的一种毁灭性病害,主要由松褐天牛传播,可危害多种松属植物。由于其发生和发展涉及到松树寄主、媒介昆虫、松材线虫、相关的微生物以及环境条件等多种因素,而且这些因素之间相互构成了复杂的关系,故给致病机理的研究和防治工作增加了难度。本文以松材线虫携带的荧光假单胞菌为材料,从该菌的培养液中分离鉴定了其分泌的一种毒蛋白,并对其对黑松的毒性进行了研究,以期为松材线虫病的致病机理研究提供参考。经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-SepharoseFF离子交换层析、Seperdex-75凝胶过滤层析等方法从松材线虫携带荧光假单胞菌的LB培养液中分离纯化出一种分子量为50 kDa的蛋白,N-末端序列为:ALSVNTNITS,同源性分析表明,该蛋白是鞭毛蛋白,体外该蛋白对黑松幼苗和悬浮细胞具有很强的毒性。该蛋白能改变黑松悬浮细胞膜的通透性,导致胞内可溶性糖和游离氨基酸的外渗,并导致胞内外过氧化物酶活性升高和新的同工酶的出现。此外,免疫细胞荧光分析表明,鞭毛蛋白与黑松悬浮细胞之间存在直接的相互作用。因此,推测松材线虫携带的荧光假单胞菌在寄主松树体内可分泌毒蛋白,并参与了松材线虫的致病过程。本文还研究了离体情况下松材线虫携带的致病菌荧光假单胞菌在LB、NB和PD三种培养基中的产毒情况。结果显示,该菌体在LB和NB液体培养基中培养时所得培养液的毒性较高,在PD培养基中几乎不产毒素,其中LB培养液的毒性最高,且培养基的pH为7时培养液的毒性高于pH为5时的毒性。体外人工合成了编码该蛋白的基因fliC,克隆到pAP3neo上,用Nde I和Xho I切下该基因片段克隆到pET-15b载体上,构建表达质粒pET-15bfliC。而后将表达质粒转入E.coli BL21(DE3)构建工程菌,工程菌经IPTG诱导表达后,破碎菌体,运用亲和层析、阴离子交换柱层析纯化重组蛋白。生测分析表明,该蛋白与野生鞭毛蛋白有相似的毒性。