“烟草转几丁质酶基因研究”论文，从外源几丁质酶基因的克隆与表达；转几丁质酶基因烟草的几丁质酶活性；激光共聚焦显微镜扫描对所转基因进行定位；转几丁质酶基因烟草当代及后代对烟草炭疽病和赤星病的抗病性；外源几丁质酶基因在转基因烟草后代中的遗传稳定性，转基因烟草植株及其调制后烟叶的转基因成分的检测方法，人工接种病毒鉴定转基因烟草对病毒的抗性等方面进行了系统的研究。 1．外源几丁质酶基因的克隆及其在烟草中表达研究 首先应用多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）将来源于baculovirus（Autogragp californica multiple nuclear polyhedrovirus,AcMNPV）的几丁质酶基因进行体外扩增，并将其插入pROK-2质粒中，再用重组质粒pROK-2 DNA转化大肠杆菌（Escherichia coli）XL1 Blue。用冻融法将重组质粒DNA转入土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404菌株中，然后用转化的土壤农杆菌LBA4404菌株接种烟草叶圆片，组织培养叶圆片获得再生烟株，并用卡那霉素对再生烟株进行初步筛选，PCR检测抗卡那霉素的再生烟株，对于PCR检测获得目的扩增片段的再生植株，用Western Blot进一步证明了目的基因在再生烟株中的表达。 2．转基因烟草几丁质酶活性的检测及所转基因在烟草组织中的表达部位研究 采用荧光定量法对转几丁质酶基因烟草当代和T₂代植株的几丁质酶活性进行了测定，结果表明，转基因烟草的几丁质酶活性明显高于未转基因烟草。体外检测几丁质酶活性发现，缓冲液的pH对转基因烟草中的几丁质酶活性有一定的影响。 对转基因烟叶进行体外包埋与切片，然后利用激光共聚焦显微镜扫描，扫描结果表明，所转几丁质酶基因主要在维管束组织中表达，在叶绿体中有少量积累。3、研究了转几丁质酶基因烟草对赤星病、炭疽病的抗病性效果 对转基因烟草T。、T；、T。、T。进行人工接种烟草炭疽病菌（COlletotr。oh删。。cot。anae）和烟草赤星病菌（Aft删删aJ。“a人 单株或单个株系进行调查，发现了病情指数明显降低的株系。4、研究了外源基因在转基因烟草株系中的遗传稳定性 从转几丁质酶基因烟草株系对卡那霉素的抗性及几丁质酶基囚蛋白表达Western blot检测）两个方面，对外源基因在转基因株系中的遗传稳定性进行了分析研究。研究结果表明，所转目的基因可在转基因烟草株系中稳定遗传。5、研究并提出了转基因植株及其调制后烟叶转基因成分检测的新方法 用含卡那霉素的培养基首先对转几丁质酶基因烟草种于和烟苗进行初步筛选鉴定，再用 Western Blot进一步证实抗卡那霉素的转基囚烟茁＊外源几丁质酶基因的表达。然后研究半嵌套式 PCR（Se。i－nested PCR）检测转几丁质酶基因烟草植株及其调制后烟ti十中的目的基因；利用限制性内切酶Hindlll对半嵌套式PCR产物进行酶切，从而验证半嵌套式盯R产物是否为真正的目的基因。研究结果表明，半嵌套式KR是一种快速、灵敏的转几丁质酶基因烟草植株及烤后烟叶的检测方法。6、风媒可否导致转基因后代基因漂移的初步研究 在温室内，采用自然风媒条件，将转基因烟卓与未转基囚亲本烟草种植在一起，让其自然开花传粉，然后检测种于，初步研究未发现转基 2 因烟草在风媒条件下可通过花粉进行基因漂移。 7、对病毒和昆虫的抗性研究 用樱桃卷叶病毒 Cherry Leaf Roll Virus)禾拟南芥花叶病毒 Mrabis Mosaic Virus)进行人工接种，试验结果未见转基因烟草症状 减轻，这表明，转基因烟草对这2种病毒无抗性。用转基因烟叶和未转 基因烟叶养虫（Hello thus叶。“ens）没有发现幼虫发育、化蛹和取食 行为的差异。 本研究在国际上首次将来源于杆状病毒山)的儿J质酶 基因导入植物(烟草人鉴定出对真菌病害具有抗性的转基因株系，发现 了转基因烟草的几丁质酶活性比未转基因的高，利用激光共聚焦显微镜 扫描对几丁质酶基因在烟草组织中的表达部位进行了定位。研究发现目 的基因在大部分转基因后代中能够稳定遗传，提出了半嵌套式PCR是检 测转几丁质酶基因烟草及其调制后烟叶的灵敏的检测方法。 烟草是我国的重要经济作物，烟草生产受病虫为害非常严重，抗性 品种的培育技术研究对提高烟草产量和改善烟叶质量具有重要的经济意 义；我国烟叶在国际贸易中占据重要地位，山于国际烟草贸易的技术壁 ．垒，因此转基因烟叶检测技术的研究将在烟叶贸易中起着非常重要的作 曾 ’用口