视网膜中央静脉阻塞(central retinal vein occlusion,CRVO)是仅次于糖尿病视网膜病变的血管性疾病,患病率在0.7-1.6%之间,常常引起严重的视力下降甚至致盲。尽管确切的机制不清,但由于血管通透性增加导致的视网膜广泛出血及黄斑水肿(cystoids macular edema,CME)是主要的原因之一。目前,已有足够的证据表明VEGF在视网膜血管性疾病的发病过程中发挥着重要的作用。分子水平上,VEGF通过调节血管内皮细胞的增殖、移行以及增加血管内皮的通透性发挥病理作用。临床研究证明玻璃体腔注射抗VEGF药物,通过抑制VEGF与其受体相结合,从而抑制脉络膜,视网膜新生血管生长及血管渗漏,可以明显改善CRVO引起的黄斑水肿,不同程度改善患者视力。在包括老年性黄斑变性(AMD),视网膜静脉阻塞(RVO)及糖尿病视网膜病变(RD)的治疗中,抗VEGF药物的玻璃体腔注射治疗已成为一线的治疗方案。然而,随着抗VEGF药物的广泛应用,仍有诸多问题有待解决:由于药物半衰期短,需要频繁行眼内注药治疗以稳定视力,增加了发生眼内炎的潜在风险;部分难治性CRVO患者经治疗后,视力及黄斑水肿并没有改善甚至恶化,即所谓“反弹”效应;长期使用出现了色素上皮细胞及感光细胞层的萎缩现象。另一方面,炎症因子可能也发挥了一定的作用,临床研究证实:多种炎症因子如:IL1β,IL6,IL8,IL10,IL12,IL13,单核细胞趋化蛋白1(MCP-1),可溶性细胞黏附因子1(Si CAM-1),干扰素等在CRVO患者的玻璃体和房水中明显升高。通过玻璃体腔注射曲安奈德,有效抑制了VEGF和炎症因子的升高,减轻CRVO患者黄斑水肿,提高视力。然而,激素的严重副作用限制了它的广泛应用,研究表明经过曲安奈德玻璃体腔注射后,48-67%的患者出现不同程度的白内障,40%有眼内压升高的表现,0.1%的眼内炎风险。因此寻找新的靶向药物势在必行。在视网膜血管疾病的病理过程中,缺氧诱导因子1(HIF-1)起到了非常重要的作用,根据文献报道,包括VEGF,EPO在内的多种血管相关因子受到HIF-1二聚体的调控。YC-1作为HIF-1α的抑制剂,通过抑制HIF-1复合体的产生,在转录水平提前遏制VEGF等多种血管相关因子的产生,同时YC-1通过调控NF-KB通道(目前认为该通道是主要的炎症因子调控通道)间接抑制炎症因子的产生。因此YC-1兼具抗VEGF及抗炎的双重作用,极具研究价值。猕猴具有与人类类似的黄斑结构,通过激光建立CRVO猕猴动物模型后,经玻璃体腔注射YC-1,可以观察眼球组织结构,特别是黄斑结构的变化,以及玻璃体和视网膜中分子水平的变化,探讨YC-1玻璃体腔注射治疗CRVO疾病的可行性。第一部分YC-1药物在正常猕猴玻璃体腔中的药物动力学研究目的:在成年猕猴玻璃体腔中注射YC-1药物,观察其药物动力学变化,为进一步应用提供初步研究数据。方法:选取正常猕猴3只,共6只眼睛,应用YC-1;化学名称为3-(5-hydroxymethyl-2-furyl)-1-benzyl indazole(中文名称:3-(5-羟甲基-2-呋喃基)-1-苯甲基吲唑)(intel number.81560 5mg Cayman Chemical);溶解在DMSO(二甲基氩砜,浓度为0.01%)药物中,稀释成200μM浓度后,抽取90μl注入猕猴玻璃体腔中,并分别在注射后0.25小时,0.5小时,1小时,2小时,3小时,4小时,5小时,6小时,8小时,10小时,抽取玻璃体标本100μl,经样品预处理后,应用高效液相色谱技术+质谱联用法检测各时间点玻璃体中YC-1的浓度变化。并应用DAS 3.0药物动力学软件及PKSolver 2.0软件,计算YC-1的药物消除半衰期等药物动力学指标。结果:结果表明,猕猴眼玻璃体液的内源性物质对YC-1及内标的测定没有干扰,保留时间分别为1.25和1.80 min,表明该方法专属性良好。相关系数r均大于0.995,表明线性良好。药物动力学研究结果显示在给药后0.25小时,药物浓度为1.217μM,0.5小时为0.824μM,1小时为0.497μM,2小时为0.368μM,3小时为0.326μM,4小时为0.265μM,5小时为0.196μM 6小时为0.145μM,8小时为0.083μM。经软件分析YC-1药物半衰期为2.79小时。结论:通过液质联用方法测量玻璃体内YC-1药物动力学的变化,专属性和精密度良好,可以应用于YC-1在猕猴玻璃体腔中的药物动力学研究,结果符合预期的实验设计。本研究通过观察不同时间组YC-1在玻璃体内的质量浓度随时间变化的规律,发现玻璃体内YC-1质量浓度随时间的延长而迅速下降。YC-1在玻璃体内的消除半衰期t1/2为2.79小时。第二部分YC-1玻璃体腔注射对正常猕猴眼部组织的毒性研究目的:对YC-1玻璃体腔注射后其对眼部组织毒性问题进行研究,以期对该药在眼部应用的安全性进行评价。方法:共3只实验用成年猕猴共6只眼睛,其中每只猴子右眼作为实验组,行YC-1 90μl(浓度为200μM)玻璃体腔注射,左眼作为对照组,行二甲基氩砜90μl(DMSO,浓度为0.01%)玻璃体腔注射。观察时间点为术前和术后1天,1周,2周,1月。测量各实验眼眼压、裂隙灯观察结膜反应、前房炎症反应以及角膜透明性,眼底照相机观察眼底病变情况。相干光断层扫描(optic coherence tomography,OCT)观察黄斑区结构,眼底荧光血管造影检查血管病变情况。进行暗适应及明适应ERG检查。并在术后1月对摘除的眼球行光镜组织学检查。结果:YC-1玻璃体腔注射后各检查时间点,所有眼球角膜透明,无前房反应,也未见玻璃体积血、视网膜脱离等并发症。眼压,黄斑中心厚度无明显差异(P>0.05)。眼底血管造影未见血管异常改变。ERG检查各组各时间点,实验组眼视杆细胞b波和视锥细胞a波和b波振幅与对照组眼相比差异无统计学意义(P>0.05)。各时间点视网膜组织学检查未见异常改变。结论:应用YC-1(90μl浓度为200μM)注射于正常猕猴眼玻璃体内,无明显炎症反应,经过1月的随访观察,对视网膜结构和功能无显著性影响。第三部分猕猴视网膜中央静脉阻塞的模型的建立及视网膜功能及结构和玻璃体相关因子的测定目的:探讨多波长激光诱导猕猴视网膜中央静脉阻塞的可行性,观察视网膜结构和功能变化,为临床进一步认识该疾病的转归提供参考。方法:选择6只健康成年猕猴,首先行裂隙灯,眼底检查,OCT检查,眼底荧光血管造影,ERG检查及眼压检查,并确认无眼部疾患后,应用多波长激光的黄光封闭6只猕猴的右眼视盘周围所有主干静脉,制成CRVO模型,随后即刻行眼底荧光血管造影证实,并于术后6小时,1天,1周,2周,1月行相同检查。同时在造模前和造模后各时间点行玻璃体腔抽取玻璃体液200μl。分别行CBA及ELASA检测玻璃体细胞因子表达变化,包括:IL6,IL8,MCP-1及VEGF和HIF-1α。1个月后摘除眼球(每只猕猴摘除1眼,共3只左眼,3只右眼),进行视网膜的HE染色及VEGF,HIF-1α,Caspase3的免疫组化观察研究。结果:6只猕猴眼睛经激光制作的CRVO模型经FFA检查均成功,结果显示眼压在术后1天及1周有轻度升高,但无显著性差异(P<0.05),虹膜面可见新生血管,黄斑水肿在1天,1周,2周有显著性升高(P<0.05),并于1月恢复到术前水平(P>0.05)。眼底可见广泛火焰出血,ERG显示视杆细胞b波和视锥细胞a波和b波显著下降(P<0.05),眼底造影提示视网膜缺血渗漏明显,并可见无灌注区及新生血管,符合人视网膜中央静脉阻塞的基本变化。通过CBA及ELASA检测玻璃体炎症因子IL-6,IL-8及MCP-1表达水平在术后不同时间点出现了显著升高(IL-6和IL-8从术后1天,MCP-1从术后2周)(P<0.05)。VEGF与HIF-1α表达也一致性升高,免疫组化研究发现,HIF-1α和VEGF在视网膜中表达明显升高,并伴有凋亡蛋白Caspase3的表达升高,光密度值均显示三种蛋白表达显著性升高(P<0.05)。结论:激光制作的CRVO猕猴动物模型在术后出现了典型的黄斑水肿,视网膜出血及无灌注区等体征。视网膜电图显示视网膜功能不同程度受到破坏。测量玻璃体和视网膜中VEGF,HIF-1α表达显著升高,同时,玻璃体中炎症因子IL-6,IL-8,MCP-1表达上调。以上结果表明血管生长因子及炎症因子均参与了实验性CRVO的发病过程,激光所致猕猴CRVO可以模拟人类CRVO的发病过程,并为进一步药物干预治疗提供理想的动物模型。第四部分YC-1玻璃体腔注射治疗猕猴实验性视网膜中央静脉阻塞的研究目的:探讨YC-1玻璃体腔注射后对CRVO猕猴动物模型眼的视网膜结构,功能及视网膜和玻璃体内各种细胞因子的影响。方法:选用健康成年猕猴6只,每只猕猴右眼为YC-1实验组,行玻璃体腔注射YC-1,左眼为DMSO对照组,行DMSO玻璃体腔注射。行激光制作CRVO动物模型后,在术后1周,分别给予实验组和对照YC-1和DMSO玻璃体腔注射,分别在注射前和注射后1天,1周,2周、1月使用裂隙灯显微镜观察角膜、房水、晶状体、前节炎症反应情况;使用眼底照相,OCT及荧光眼底血管造影评估视网膜结构变化情况,并行眼压检查。同时采取玻璃体样本200μl,应用CBA及ELASA检测各时间点玻璃体样本中VEGF、HIF-1α、IL-6、IL-8、MCP-1等细胞因子的表达。并行ERG视网膜电图检查评估视网膜功能情况。随后在1个月时摘除眼球行HE染色及视网膜免疫组化研究。通过免疫组化方法检测视网膜中VEGF、HIF-1、Caspase3的表达。结果:YC-1实验组与DMSO对照组,经注射药物后,两组均可见虹膜面新生血管,视网膜出血,无灌注区及新生血管。各时间点,两组间眼压未见显著性差异(P<0.05)。OCT检查可见黄斑区明显水肿,给予YC-1和DMSO注射后,发现在YC-1实验组,黄斑区水肿消退显著。在注射后1天,1周和2周均较DMSO对照组有显著性差异。ERG检查发现,给予YC-1玻璃体腔注射后1周视网膜电图的rod b波和cone a和b波均较DMSO组有显著改善。应用YC-1玻璃体腔注射后,IL-6、IL-8均得到明显的抑制,而MCP-1尽管有轻度降低,但与DMSO对照组比较没有显著性差异。此外,在应用YC-1后,玻璃体中HIF-1α和VEGF的表达显著降低,HE染色发现YC-1和DMSO二组的视网膜内核层和外核层细胞均较正常视网膜显著减少。免疫组化研究发现在YC-1治疗组,视网膜中HIF-1α,VEGF及Caspase3三种抗体的表达均显著受到抑制,应用图像分析系统测量了三种抗体在视网膜表达的光密度值,证实了三种蛋白表达均较DMSO组显著降低。结论:在造模后一周时,YC-1玻璃体腔注射后,可以显著改善黄斑水肿的程度,加快水肿吸收,改善ERG中视杆细胞b波和视锥细胞的a波和b波的波幅。同时抑制IL-6、IL-8、VEGF、HIF-1α在玻璃体内的表达,轻度抑制MCP-1的表达。在视网膜中降低VEGF和HIF-1α的表达,减少细胞凋亡,对视网膜细胞有保护作用。基于上述研究结果可以得出以下结论:1应用YC-1玻璃体腔注射对猕猴眼睛无明显毒性反应,对视网膜功能及结构无明显影响。2多波长激光制作猕猴CRVO动物模型,可实现模拟人眼CRVO的表现,其视网膜体征和功能均有一定相似性,可作为理想的实验模型,进行相关的药物研究。3应用YC-1玻璃体腔注射治疗激光诱导的猕猴CRVO动物模型,结果表明YC-1可以减轻黄斑水肿程度,改善视网膜功能,迅速抑制CRVO引起的玻璃体和视网膜中各种炎症因子及VEGF和HIF-1α的升高,降低视网膜细胞的凋亡程度,具有潜在的临床使用价值。