烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)是侵染烟草植物的最严重的病毒之一,该病分布广泛,造成了巨大的经济损失。对于这类病害,植物源活性物质防治是一种有效而又环保的措施。因此,从植物中筛选出对病毒有很好抑制作用的活性物质十分重要。作者所在的实验室已经从中草药鸦胆子(Brucea javanica(L.)Merr)中分离到了一种活性物质——鸦胆子素D(Brucein D),经初步测定,其对烟草花叶病毒(TMV)具有很好的抑制作用。以绿色荧光蛋白(green fluoresence protein, GFP)为报告基因能更直观便捷的观察TMV在受体植株内的表达情况。本实验以把GFP基因融合到TMV基因上构建的载体p35S:30B:GFP为供试病毒载体,分别从烟草植株水平和原生质体水平研究了植物源活性物质Brucein D对植物病毒TMV的抑制效果。采用农杆菌接种法把含有GFP报告基因的TMV表达载体p35S:30B:GFP注射到了本氏烟植株叶片上,注射时混合使用不同浓度的Brucein D处理,一段时间后通过观测绿色荧光蛋白的表达情况,筛选出了Brucein D抑制TMV的最佳工作浓度为10μg/mL;分别对注射两周后本氏烟草新生叶片进行PCR和western blot检测,在未加Brucein D的叶片上检测到了CP、GFP基因和CP、GFP的蛋白表达;在加有10μg/mL的Brucein D的植株叶片上检测不到这两个基因和两种蛋白的表达。激光共聚焦显微镜在未加Brucein D的叶片上观察到含有绿色荧光的细胞;在加有10μg/mL的Brucein D的植株叶片上没有观察到绿色荧光,与前者结果相符合。实验结果还发现Brucein D对TMV的抑制具有时效性,通过观察农杆菌转染后本氏烟植株上绿色荧光蛋白的表达,确定其抑制增殖的有效时间为3-4周。分离出了本氏烟草叶肉原生质体,并对影响原生质体分离产率的几个因素进行了研究,结果表明,当酶解时间为4小时、酶解的叶片采自植株上部新生刚展开的部位、真空抽滤30 min、酶解液pH值为6.0左右时,分离得到的原生质体数目最多,为最佳组合。利用PEG介导法成功的将外源DNA转化到本氏烟草原生质体内,48小时后检测,报告基因GFP得到表达。原生质体悬浮液中以加有10μg/ml Brucein D和不加Brucein D为不同处理,结果同样表明Brucein D可以抑制TMV在离体细胞内的增殖。采用摩擦接种法把TMV病毒粒子接种到普通烟草K326株系上,两周后ELISA检测,结果表明,Brucein D同样能有效抑制TMV在普通烟草体内的增殖。