目的视网膜接收视觉信号,并将其中所包含的视觉信息编码成不同序列的神经冲动传向大脑。不同的信号传递通路参与处理不同的视觉信息。视锥通路参与编码光强度相对较高的明视觉信息,视杆通路参与编码光强度相对较低的暗视觉信息。在不同强度光适应条件下,光的增强和减弱信号分别通过不同的视锥、视杆信号传递通路进行处理。传递光增强信号的通路称为On-通路,传递光减弱信号的通路称为Off-通路。在暗视觉条件下,光的增强信号是由两条DL-2-氨基-4-磷丁酸(DL-2-amino-4-phosphonobutyric acid, APB)敏感的视觉通路进行传递的：①视杆细胞→视杆双极细胞→AⅡ型无长突细胞→紧密连接→On视锥双极细胞→On神经节细胞。②视杆细胞→紧密连接→视锥细胞→On视锥双极细胞→On神经节细胞。APB可阻断这两条通路的信号传导。光的减弱信号是由三条不同的APB敏感和不敏感的视杆Off-通路进行处理的：①视杆细胞→视杆双极细胞→AⅡ型无长突细胞→甘氨酸能突触→Off视锥双极细胞→Off神经节细胞。②视杆细胞→紧密连接→视锥细胞→Off视锥双极细胞→Off神经节细胞。③视杆细胞→直接与Off视锥双极细胞相联系→Off神经节细胞。①为APB敏感的视杆Off-通路,②和③为APB不敏感的视杆Off-通路。在明视觉条件下,处理光增强信号的通路为：视锥细胞→On视锥双极细胞→On神经节细胞；处理光减弱信号的通路为：视锥细胞→Off视锥双极细胞→Off神经节细胞。研究发现,暗视觉条件下,APB敏感的视杆Off-通路的光反应阈值低于APB不敏感的视杆Off-通路；对人类视网膜的研究发现,存在传递慢的、低强度光信号和传递快的、高强度光信号的两条视杆通路；一氧化氮(nitric oxide, NO)可选择性地阻断雪貂视网膜APB敏感的视杆Off-通路的Off光反应；暗视觉条件下,神经元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)缺乏可降低视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)的光敏性。由此可见,不同的On-/Off-通路分别具有不同的功能特性和调节机制。众所周知,视网膜中,各视觉通路最终都会聚在各自的神经节细胞上,故神经节细胞的反应反映了视网膜中视觉信号处理的最终结果。因此,为了进一步明确这些视觉通路不同的光反应特性、光刺激-反应关系、NO对神经节细胞光敏性的影响及不同通路功能特性的调节机制,本研究采用全细胞电流钳及电压钳技术对神经节细胞进行了记录。方法1、C57BL／6小鼠视网膜铺片。2、通过带有绿色(P-43,545nm光线)磷光体的阴极射线管发出方波光斑刺激,照射视网膜以诱发RGC光反应。3、暗视觉条件下,电流钳记录APB敏感和不敏感的视杆Off-通路中RGC的光反应,并对反应的最高放电频率和潜伏时进行测定。4、暗、明视觉条件下,电流钳记录不同On-和Off-通路中RGC对不同频率闪光刺激的光反应,分析其对闪光刺激的频率跟随能力。5、暗视觉条件下,应用NO供体,S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpeni-cillamine, SNAP),观察其对APB敏感和不敏感的视杆Off-通路中RGC光反应的影响。6、明视觉条件下,记录RGC的自发和光诱发的兴奋性和抑制性突触后电压和电流,观察一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)的抑制剂,nω-硝基-L-精氨酸甲酯(Nω-Nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)对RGC光敏性的影响并探讨其机制。7、应用激光共聚焦显微镜,对标记的RGC进行分层扫描,拍照并进行三维重建以判断RGC的分型。结果1、暗视觉条件下,APB敏感的视杆Off-通路中RGC的Off光反应的潜伏时显著长于APB不敏感视杆Off-通路,而两条通路中RGC的Off光反应的最高放电频率无显著差异。2、暗视觉条件下,APB敏感视杆Off-通路中RGC的Off光反应所能跟随的最高闪光刺激频率显著低于APB不敏感视杆Off-通路。视杆On-通路的神经节细胞所能跟随的最高闪光刺激频率显著高于APB敏感的视杆Off-通路。由暗视觉转到明视觉条件下,APB敏感和不敏感的视杆Off-通路中RGC的Off光反应所能跟随的闪光刺激频率均显著升高。3、暗视觉条件下,NO选择性地阻断小鼠视网膜上APB敏感的视杆Off-通路的光反应。4、明视觉条件下,L-NAME降低On-/Off-通路中RGC的光敏性。5、明视觉条件下,L-NAME降低了On-/Off-通路中RGC的自发和光诱发的抑制性突触后电流(inhibitory postsynaptic current, IPSC)的幅度。应用士的宁(strychinine, STR)和印防己毒素(picrotoxin, PTX)消除抑制性突触输入后,L-NAME可显著降低RGC的自发和光诱发的兴奋性突触后电流(excitatory postsynaptic current, EPSC)的幅度,减少自发性EPSC (spontaneous EPSC, sEPSC)的发生频率。6、在明视觉条件下,应用羟基胺(hydroxylamine, HA)漂白视锥细胞后,L-NAME对RGC的sEPSC的幅度和发生频率无显著影响。在应用APB减少谷氨酸释放到RGC后,L-NAME对RGC的sEPSC的幅度和发生频率无显著影响。讨论我们的实验结果显示,小鼠视网膜上不同的On-／Off-通路确实存在不同的功能特性和调节机制。暗视觉条件下,APB敏感视杆Off-通路中RGC的Off光反应的潜伏时显著长于APB不敏感视杆Off-通路。可能的原因有二：①APB敏感和不敏感的视杆Off-通路的视网膜环路不同,APB敏感比不敏感的视杆Off-通路中的突触数目多。②APB敏感的视杆Off-通路信号传递效率较低。另外,实验还发现APB不敏感的视杆Off-通路中RGC的光反应能稳定跟随较高频率的闪光刺激。也有研究发现,APB敏感的视杆Off-通路光刺激阈值低于APB不敏感的视杆Off-通路。因此,我们认为,APB敏感的视杆Off-通路处理低频率、低强度的光减弱信号,并向大脑传递信号的速度较慢；而APB不敏感的视杆Off-通路介导频率和强度相对较高的光减弱信号,且将信号传向大脑速度较快。以往研究显示,NO可选择性地阻断雪貂视网膜APB敏感的视杆Off-通路的Off反应。我们的实验发现在小鼠的视网膜上也存在这一现象。这一结果表明,APB敏感和不敏感的视杆Off-通路不仅分别传递不同的视觉信息,而且也存在着不同的调节机制。从小鼠和雪貂视网膜的研究结果来看,NO对APB敏感视杆Off-通路的特异性调节可能是适用于不同种系动物的一个普遍现象。通过暗、明视觉条件的转换,我们可以推断出限控不同通路闪光刺激频率跟随特性的部位。暗视觉条件下,位于APB敏感的视杆Off-通路的神经节细胞,在转换到明视觉条件后,能跟随的闪光刺激频率显著升高,而暗视觉条件下,位于视杆On-通路的神经节细胞所能跟随的最高闪光频率显著高于APB敏感的视杆Off-通路,这些结果证明,在该通路中,视杆细胞,视杆双极细胞,AⅡ型无长突细胞和Off视锥双极细胞,Off神经节细胞能跟随高频率的闪光刺激。因此,我们推测,位于AⅡ型无长突细胞与Off视锥双极细胞之间的甘氨酸能突触很可能限控了APB敏感的视杆Off-通路的频率跟随能力。光照时(即给光时),AⅡ型无长突细胞释放甘氨酸抑制Off视锥双极细胞,因而,Off视锥双极细胞到Off神经节细胞的突触输入减少。撤光时,AⅡ型无长突细胞停止向Off视锥双极细胞释放甘氨酸,后者对Off视锥双极细胞的抑制作用被解除了,从而允许Off视锥双极细胞向Off神经节细胞释放谷氨酸以诱发Off光反应。解除甘氨酸对Off视锥双极细胞的抑制作用可触发APB敏感的视杆Off-通路的Off光反应。当闪光刺激频率较高时,每一次给光和撤光的时间均缩短,影响了甘氨酸对Off视锥双极细胞的抑制作用的产生和接触,因而限制了高频率的闪光刺激信号通过APB敏感的视杆Off-通路。应用类似的方法,我们检测了APB不敏感的视杆Off-通路的闪光刺激频率跟随特性。结果表明,在APB不敏感的视杆Off-通路中的Off视锥双极细胞和Off神经节细胞本身能够跟随高频率的闪光刺激。因此,我们推断,APB不敏感的视杆Off-通路的频率跟随能力的限控机制存在于视杆或视锥细胞中。有研究表明,视锥细胞比视杆细胞反应速率更快。视觉通路中,频率跟随能力最低的部分将会成为限制高频率光信号通过的主要成分。因此,我们认为,在APB不敏感的视杆Off-通路中,视杆细胞可能为限控该通路频率跟随特性的主要机制所在。以往研究已显示,暗视觉条件下,NO选择性地阻断APB敏感的视杆Off-通路,减少NO可降低RGC的光敏感性。本研究结果发现,在阻断了抑制性突触电流后,L-NAME显著降低了RGC的自发的和光诱发的EPSC幅度,降低了sEPSC的发生频率。这些结果进一步支持了NO具有刺激兴奋性神经递质释放的作用这一观点。因此,我们推测L-NAME可通过降低视网膜中内源性NO含量,从而减少对RGC的兴奋性突触输入,降低其对光的敏感性。在本部分研究中,我们还对L-NAME通过抑制NOS的活性,减少RGC兴奋性突触电流的可能机制进行了探讨。结果显示,在光漂白视锥细胞后,无论是否应用STR和PTX, L-NAME均不能降低sEPSC的发生频率,因此提示,在明视觉条件下,L-NAME可能作用于视锥细胞以减少突触前谷氨酸递质的释放,从而减少RGC的sEPSC,降低其光敏性。明视觉条件下,L-NAME降低RGCs的敏感性的作用可能也涉及其它的机制,有待进一步研究。结论1、APB敏感的视杆Off-通路处理低频率、低强度的光减弱信号,并向大脑传递信号的速度较慢；而APB不敏感的视杆Off-通路介导频率和强度相对较高的光减弱信号,且将信号传向大脑速度较快。2、NO选择性调节小鼠视网膜APB敏感的视杆Off-通路。3、位于AⅡ型无长突细胞与Off视锥双极细胞之间的甘氨酸能突触很可能限控了APB敏感的视杆Off-通路的频率跟随特性。4、视杆细胞限制了APB不敏感的视杆Off-通路的闪光刺激频率跟随特性。5、明适应条件下,L-NAME可能通过抑制视锥细胞中NOS的活性,降低NO水平,使其谷氨酸释放减少,RGC的兴奋性突触电流减弱,从而降低其光敏性。