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单宁是杨树体内非常重要的一类次生代谢化合物,广泛参与了杨树抗病、抗虫、抵御紫外辐射等生理过程。为了阐明杨树中单宁的生物合成代谢途径,本研究克隆了杨树单宁合成途径中关键酶基因PtrLAR1、PtrLAR3和PtrANR,氨基酸序列比对发现,PtrLAR1、PtrLAR3和PtrANR与其它物种的同源基因具有较高的相似性,进化分析结果表明,PtrLAR1、PtrLAR3和PtrANR与木本植物的同源基因具有较近的亲缘关系。半定量和荧光定量PCR分析PtrLARs和PtrANR基因的组织特异性发现,它们均在根中大量表达。对毛白杨不同组织缩合单宁含量的测定显示,缩合单宁也在根中含量最高,这些结果表明PtrLAR1、PtrLAR3和PtrANR可能参与了缩合单宁的代谢合成。为进一步验证PtrLAR1、PtrLAR3和PtrANR基因的功能,将这些基因分别转化毛白杨,获得转基因植株。测定转基因植株中缩合单宁的含量发现,超量表达PtrLAR1、 PtrLAR3和PtrANR均导致转基因植株中可溶性缩合单宁含量显著增加,显示这些基因均参与了单宁的生物合成。为了检测PtrLAR和PtrANR超量表达是否影响了花青素的合成,我们也检测了转基因植株花青素的含量。发现在PtrLAR1和PtrANR转基因植株中花青素含量均有明显降低,该结果暗示超量表达PtrLAR1和PtrANR导致缩合单宁含量增加,但影响了花青素的合成。HPLC测定转基因植株中单宁的单体发现,超量表达PtrANR提高了转基因植物中表儿茶素的含量,而超量表达PtrLAR1同时提高了缩合单宁的两种单体——儿茶素和表儿茶素的含量。前人研究表明,在拟南芥中未发现LAR及其同源基因,也未检测到儿茶素。为了进一步验证PtrLAR1的功能,将PtrLAR1转化拟南芥进行互补实验。HPLC检测发现,在转PtrLLAR1拟南芥中检测到了儿茶素的大量合成,并且表儿茶素的含量也有所提高,该结果表明,PtrLAR1能同催化儿茶素和表儿茶素两种缩合单宁单体的合成。植物中单宁的存在可提高其抗病性。在毛白杨叶片表面接种黑斑病菌48h后,数字表达谱(DEG)检测黄酮代谢途径上关键酶基因的表达情况发现,该途径中大多数关键酶基因均明显上调,其中PtrLAR3提高尤为显著,同时感染黑斑病的叶片中缩合单宁含量有了明显提高,推测PtrLAR3的表达可能与杨树的抗病性相关。离体抗病实验表明,超量表达PtrLAR3的转基因毛白杨叶片细胞粗提液能够抑制黑斑病的菌丝生长,活体接种实验显示,接种病原菌4d后转基因植株叶片的病斑面积明显小于野生型植株。RT-PCR分析显示转基因植株中PtrLAR3的表达量显著上调。这些结果表明,通过超量表达PtrLAR3可有效提高毛白杨的抗病能力。