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类风湿关节炎(RA,rheumatoid arthritis)是最常见且严重的自身免疫性疾病之一,可导致患者丧失生活自理能力乃至残疾。迄今为止,类风湿关节炎的病因和发病机制仍未明确、阐明,且针对类风湿关节炎病因的研究在可期的时间内难以取得突破,致力于开发对因治疗药物或治疗方式的研究更是难以实施。因此,阻止病程发展是治疗类风湿关节炎的首要任务和最佳选择。滑膜炎症起始于疾病初期,贯穿整个病程,是驱使类风湿关节炎病程发展,导致患病关节功能丧失,致使患者残疾的主导因素之一,也是类风湿关节炎的主要且关键的病征。在类风湿关节炎的临床治疗中,控制炎症是首选且必要的策略,是阻止病程发展的关键。但是,滑膜炎症的发病机理及其分子机制仍未完全阐明,针对炎症反应过程开发的药物和治疗方式只能缓解滑膜炎症,并不能控制或阻止滑膜炎症的发生发展。这导致接受治疗的类风湿关节炎患者的病情仍在发展,且随着病程的延长,患病关节会丧失功能,患者最终丧失生活自理能力乃至残疾。所以,阐明滑膜炎症的发病机制是控制滑膜炎症发生发展以阻止类风湿关节炎病程发展的关键所在。酸敏感离子通道1a(acid sensing ion channel 1a,ASIC1a)是细胞外酸化信号瞬时激活的非电压门控性阳离子通道,能够介导细胞外钠离子和钙离子的内流。课题组之前的研究已经发现,ASIC1a作为细胞膜上的酸感受器,将细胞外酸化信号传递到细胞内,导致大鼠关节软骨细胞发生凋亡、焦亡以及程序性坏死,从而造成关节软骨的破坏,最终驱使类风湿关节炎病程的发展。而且,ASIC1a更是作为炎症的介导者,驱动炎症的发生发展。因此,ASIC1a可能是阐明滑膜炎症发病机制的重要突破口。此项研究采用人原代正常滑膜成纤维细胞(normal synovial fibroblast,NSF)和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(rheumatoid arthritis synovial fibroblast,RASF)进行体外实验,采用佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠模型进行体内实验,以明确ASIC1a在滑膜炎症中的作用,阐明其作用机制,为开发可控制滑膜炎症的新药提供潜在靶点,也为类风湿关节炎的治疗及研究提供新思路,使阻止类风湿关节炎病程发展成为可能。目的:通过体外实验阐明ASIC1a在类风湿关节炎滑膜炎症中的作用,以确证ASIC1a为滑膜炎症的关键介导者,并进一步阐明ASIC1a介导滑膜炎症的分子机制;通过体内实验,明确ASIC1a在滑膜炎症中的作用以及对类风湿关节炎病程发展的影响。方法:1.采用免疫组化法和免疫荧光法检测ASIC1a在3例人正常滑膜组织和22例人类风湿关节炎滑膜组织中的表达水平。2.采用组织块贴壁法提取分离人原代正常滑膜成纤维细胞和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞。标记滑膜成纤维细胞的特异性表面抗原CD55,应用流式细胞术鉴定提取分离的滑膜成纤维细胞。3.采用Western blotting法检测ASIC1a总蛋白在人原代正常滑膜成纤维细胞和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达水平。4.采用细胞膜蛋白提取试剂盒提取分离人原代正常滑膜成纤维细胞和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的膜蛋白,再利用Western blotting法检测ASIC1a膜蛋白在人原代正常滑膜成纤维细胞和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达水平。5.采用免疫荧光法检测ASIC1a在人原代正常滑膜成纤维细胞和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达水平。6.采用流式细胞术检测ASIC1a膜蛋白在人原代正常滑膜成纤维细胞和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达水平。7.使用携带ASIC1a shRNA的慢病毒转染类风湿关节炎滑膜成纤维细胞,构建ASIC1a基因沉默细胞模型。随后,采用Western blotting法和免疫荧光法检测转染完成的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中ASIC1a的表达情况,以筛选构建成功的ASIC1a基因沉默细胞。8.使用携带ASIC1a基因表达质粒的慢病毒转染类风湿关节炎滑膜成纤维细胞,构建ASIC1a基因过表达细胞模型。随后,采用Western blotting法和免疫荧光法检测转染完成的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中ASIC1a的表达情况,以筛选构建成功的ASIC1a基因过表达细胞。9.采用Western blotting法和流式细胞术检测ASIC1a膜蛋白在ASIC1a基因沉默细胞、ASIC1a基因过表达细胞中的表达水平。10.使用特异性钙离子荧光探针Fluo 3-AM标记细胞内游离的钙离子,然后应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测人原代正常滑膜成纤维细胞和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的钙离子水平。11.在pH 6.0的酸性环境下刺激类风湿关节炎滑膜成纤维细胞45 min、1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h后,使用特异性钙离子荧光探针Fluo 3-AM标记细胞内游离的钙离子,然后应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的钙离子水平。12.使用特异性ASIC1a抑制剂PcTx-1(psalmotoxin 1)抑制ASIC1a的活性后,利用特异性钙离子荧光探针Fluo 3-AM标记细胞内游离的钙离子,然后应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的钙离子水平。13.在pH 6.0的酸性环境下刺激ASIC1a基因沉默细胞和ASIC1a基因过表达细胞6 h后,使用特异性钙离子荧光探针Fluo 3-AM标记细胞内游离的钙离子,然后应用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞内钙离子水平。14.使用特异性钙离子荧光探针Fluo 3-AM孵育类风湿关节炎滑膜成纤维细胞,然后应用激光共聚焦显微镜记录pH 6.0酸液刺激时细胞外钙离子内流情况。15.利用酸化刺激、特异性抑制剂、基因沉默或过表达手段干预ASIC1a的活性后,使用固相抗体芯片技术检测40个关键的炎症因子表达量,同时利用GO富集分析和KEGG信号通路富集分析验证炎症因子的生物学功能及参与的病理生理过程。16.使用Luminex液相芯片技术和ELISA法验证固相抗体芯片技术得到的实验结果。17.分别使用细胞外钙离子螯合剂EGTA、细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM、特异性钠氢交换体抑制剂HMA与钙通道阻滞剂维拉帕米处理类风湿关节炎滑膜成纤维细胞,然后使用Luminex液相芯片技术和ELISA法检测上述实验验证的6个炎症因子,即 RANTES、sTNF RI、MIP-1a、IL-8、sTNF RII、ICAM-1。18.使用完全弗氏佐剂(Complete Freund’s adjuvant,CFA)构建AA大鼠模型。19.在AA大鼠踝关节腔内注射特异性ASIC1a抑制剂PcTx-1,剂量为0.5μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg,然后使用足趾容积测量仪记录大鼠踝关节肿胀度,并对关节炎症进行评分。20.采用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE staining)对 AA 大鼠踝关节进行病理检查和评价。21.采用免疫组化法检测AA大鼠踝关节滑膜组织中ASIC1a以及炎症因子RANTES、sTNF RI、MIP-1a、IL-8、sTNF RII、ICAM-1 的表达量。22.采用免疫组化法和免疫荧光法检测NFATc1、c2、c3、c4和5在3例人正常滑膜组织和22例人类风湿关节炎滑膜组织中的表达水平。23.采用免疫组化法检测NFATc1、c2、c3、c4和5在AA大鼠踝关节滑膜组织中的表达水平。24.采用免疫荧光法和Western blotting法检测NFATc1、c2、c3、c4和5在人原代正常滑膜成纤维细胞和类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达水平。25.在pH 6.0的酸性环境下刺激类风湿关节炎滑膜成纤维细胞45 min、1.5 h、3 h、6 h、12 h、24 h后,采用免疫荧光法和Western blotting法检测NFATc1、c2、c3、c4的核易位水平。26.使用特异性ASIC1a抑制剂PcTx-1(psalmotoxin 1)抑制ASIC1a的活性后,采用免疫荧光法和Western blotting法检测NFATc1、c2、c3、c4的核易位水平。27.在pH 6.0的酸性环境下刺激ASIC1a基因沉默细胞和ASIC1a基因过表达6 h后,采用免疫荧光法和Western blotting法检测NFATc3的核易位水平。28.分别使用细胞外钙离子螯合剂EGTA、细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM、特异性钠氢交换体抑制剂HMA与钙通道阻滞剂维拉帕米处理类风湿关节炎滑膜成纤维细胞,然后采用免疫荧光法和Western blotting法检测NFATc3的核易位水平。29.使用携带NFATc3 shRNA的慢病毒转染类风湿关节炎滑膜成纤维细胞,构建NFATc3基因沉默细胞模型。随后,采用Western blotting法和免疫荧光法检测转染完成的类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中NFATc3的表达情况,以筛选构建成功的NFATc3基因沉默细胞。30.采用染色质免疫共沉淀-实时荧光定量聚合酶链式反应法(ChIP-qPCR)和双荧光素酶报告基因实验检测NFATc3对RANTES基因转录的影响,采用Luminex液相芯片技术检测NFATc3对RANTES蛋白表达的影响。结果:1.与人正常滑膜组织相比,ASIC1a在类风湿关节炎滑膜组织中的表达量显著增加。2.与人原代正常滑膜成纤维细胞相比,ASIC1a总蛋白及膜蛋白在人原代类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的表达明显增加。3.与人原代正常滑膜成纤维细胞相比,人原代类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的钙离子水平明显增加。4.利用pH 6.0酸性环境激活ASIC1a后,人原代类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中的钙离子水平随刺激时间逐渐增加,6 h时达到稳态。5.ASIC1a介导人原代类风湿关节炎滑膜成纤维细胞外钙离子内流,从而增加细胞内钙离子水平。6.ASIC1a通过介导人原代类风湿关节炎滑膜成纤维细胞外钙离子内流增强炎症因子 RANTES、sTNF RI、MIP-1a、IL-8、sTNF RII、ICAM-1 的表达,其中RANTES的表达显著增加,增加水平最为明显。7.在体内实验中,抑制ASIC1a的活性可以明显减轻AA大鼠关节肿胀度和炎症程度。同时,AA大鼠踝关节滑膜组织内RANTES、sTNF RI、MIP-1a、IL-8、sTNF RII、ICAM-1的表达明显减弱。8.与人正常滑膜组织相比,NFATc1、c3在类风湿关节炎滑膜组织中的表达量显著增加,NFATc2、c4表达微弱增加。但是,NFAT5在两种组织中的表达均很微弱。9.与人原代正常滑膜细胞相比,人原代类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中NFATc1、c3总蛋白与核蛋白表达明显增加,NFATc2、c4和5总蛋白表达微弱增加,但核蛋白表达没有明显差异。10.利用pH 6.0酸性环境激活ASIC1a后,人原代类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中NFATc1、c3总蛋白随刺激时间逐渐增加,并在6h时达到稳定。NFATc2、c4总蛋白表达微弱增加。但是,只有NFATc3核蛋白表达随酸刺激时间逐渐增加,且在6 h时达到稳定。11.使用特异性ASIC1a抑制剂PcTx-I抑制ASIC1a活性后,只有NFATc3总蛋白与核蛋白表达不再响应酸刺激而增加。12.沉默ASIC1a后,与对照组相比,NFATc3总蛋白与核蛋白表达不再响应酸刺激而增加;过表达ASIC1a后,与对照组相比,NFATc3总蛋白与核蛋白表达响应于酸刺激而明显增加。13.在人原代类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中,ASIC1a通过介导细胞外钙离子内流促进NFATc3的核转移。14.NFATc3与RANTES基因的启动子结合,从而调控RANTES基因转录以及蛋白表达。结论:1.ASIC1a诱导类风湿关节炎滑膜炎症。2.ASIC1a通过介导细胞外钙离子内流激活NFATc3,从而调控RANTES基因转录以及蛋白表达,最终诱导类风湿关节炎滑膜炎症。