现有研究和本课题组的前期实验均已证实,在肾小管-间质纤维化过程中,转录共抑制因子SnoN（Ski-related novel protein N）蛋白水平的减少受到基因转录和泛素化降解两个方面的影响。我们设想是否可从基因转录和蛋白稳定性两个方面,增加或恢复糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）发病过程中肾小管上皮细胞内源性SnoN蛋白的表达水平,以延缓或治疗DN。综合前人研究发现,骨形成蛋白-7（Bone morphogenetic protein 7,BMP-7）治疗或延缓纤维化疾病的效应与SnoN的作用机制,以及调控SnoN表达的因子和通路密切相关。而且我们发现在DN纤维化过程中BMP-7通过上调SnoN蛋白表达水平对抗转化生长因子β1（Transforming growth factor beta 1,TGF-β1）的致纤维化效应,但这种关系以及作用环节和分子机制均需要进一步研究证实。目的:从基因转录和蛋白稳定性两方面探讨BMP-7对高糖条件下肾小管上皮细胞中SnoN表达调控的作用环节和分子机制,明确BMP-7对SnoN表达调控的胞内信号通路,证实BMP-7是否通过降低SnoN蛋白泛素化水平及肾组织中SnoN蛋白降解的强度而恢复SnoN蛋白水平。为进一步阐明DN肾小管-间质纤维化的发病机制,寻找新的有效治疗靶点提供理论依据。方法:（1）细胞实验:通过Western blot鉴定肾小管上皮细胞（Renal tubular epithelial cells,RTECs）细胞表型,再给予如下处理:（1）正常糖[DMEM（含糖5.5mmol/L）+2%FBS]和高糖[DMEM（含糖5.5mmol/L+19.5mmol/L）+2%FBS]培养的RTECs细胞转染过表达BMP-7质粒,Western blot检测各组细胞BMP-7、上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-Cadherin）、间充质细胞标志物波形蛋白（Vimentin）和细胞外基质蛋白胶原III（Collagen III）蛋白表达的影响。（2）予高糖培养的RTECs细胞12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL和200ng/mL浓度的rhBMP-7刺激,Western blot检测各组细胞E-Cadherin和Collagen III蛋白表达变化。Western blot检测各组细胞在最适浓度的rhBMP-7刺激下在6h、12h、24h和48h的E-Cadherin和Collagen III蛋白表达变化,并检测48h时细胞SnoN、Smad1、Smad5和p-Smad1/5^{（ser463/465）}蛋白水平变化,免疫细胞荧光检测细胞E-Cadherin、α-SMA和SnoN蛋白表达变化,Real-Time PCR检测细胞SnoN mRNA水平。（3）高糖培养的RTECs细胞给予rhBMP-7刺激并共同转染敲低或过表达Smad1/5质粒,Western blot检测各组细胞SnoN、Smad1、Smad5、p-Smad1/5^{（ser463/465）}、E-Cadherin、Vimentin和Collagen III蛋白表达水平,Real-Time PCR检测各组细胞Smad1、Smad5和SnoN mRNA水平。（2）动物实验:对18只C57BL小鼠复制1型糖尿病模型（DM组）,匹配相同数量和鼠龄的正常小鼠做对照（NC组）,4周后,再将两组小鼠再分别随机平均分成NC+Control组,NC+Vector组,NC+BMP-7组,DM+Control组,DM+Vector组和DM+BMP-7组,其中在NC和DM小鼠中BMP-7组和Vector组小鼠分别经过尾静脉注入质量为15ug的BMP-7过表达质粒或对应空载质粒,每周注射一次,6周后处死。免疫组织化学和免疫荧光技术检测各组小鼠BMP-7、α-SMA和Collagen III蛋白表达水平,Western blot检测各组小鼠肾组织SnoN、Smad1、Smad5、p-Smad1/5^{（ser463/465）}、E-Cadherin、Vimentin和Collagen III蛋白表达水平,免疫共沉淀检测各组小鼠肾组织SnoN蛋白泛素化水平,Real-Time PCR检测各组小鼠SnoN mRNA水平。结果:（1）细胞实验:通过Western blot实验检测NG组细胞发现上皮细胞标志物E-Cadherin呈现高表达而间充质细胞标志物Vimentin呈现低表达,这表明细胞为上皮细胞来源,而HG刺激后细胞E-Cadherin呈现低表达而Vimentin呈现高表达。（1）高糖转染过表达BMP-7质粒后,细胞BMP-7和E-Cadherin表达明显增加,而Vimentin和CollagenIII蛋白表达减少。（2）高糖条件下随着rhBMP-7刺激浓度的增加,从50ng/mL开始E-Cadherin蛋白表达水平逐渐明显增加,而Collagen III蛋白水平从25ng/mL开始逐渐减少,因此我们后续实验选用100ng/mL的rhBMP-7刺激细胞。与高糖培养的RTECs细胞相比,随着rhBMP-7刺激时间的延长,48h时,细胞E-Cadherin蛋白表达明显增加,而Collagen III蛋白水平显著下降,并且SnoN mRNA和蛋白表达增加,p-Smad1/5^{（ser463/465）}表达增多。（3）对高糖条件下给予rhBMP-7刺激的RTECs细胞共同转染敲低Smad1/5基因的质粒后,发现Smad1、Smad5的mRNA和蛋白明显减少,p-Smad1/5^{（ser463/465）}表达减少,细胞纤维化病变进一步增加,并且发现SnoN mRNA和蛋白表达减少。相反对高糖条件下给予rhBMP-7刺激的RTECs细胞共同转染过表达Smad1/5基因的质粒后,细胞Smad1、Smad5的mRNA和蛋白表达明显增加,p-Smad1/5^{（ser463/465）}表达增加,细胞纤维化病得到改善,并且SnoN mRNA和蛋白表达也相应增加。（2）动物实验:各组小鼠肾组织形态和免疫组化荧光染色发现,与NC+Control组比较,DM+Control组小鼠肾组织出现了肾小球硬化,炎性细胞浸润等纤维化病理改变,伴随细胞外基质Collagen III沉积增多,α-SMA表达增多,而糖尿病小鼠给予BMP-7治疗后上述病变得到明显改善,并且Collagen III沉积减少,α-SMA表达也减少。Real-Time PCR和Western blot结果显示,与NC+Control组比较,DM+Control组小鼠肾组织BMP-7蛋白表达减少,并且SnoN mRNA表达增加蛋白表达减少;而DM+BMP-7组与DM+Control组比较,BMP-7蛋白表达增加,而SnoN mRNA和蛋白表达均进一步增加。Western blot结果显示,DM+BMP-7组小鼠较DM+Control组小鼠肾组织中p-Smad1/5^{（ser463/465）}和E-Cadherin蛋白表达增加,而Collagen III和Vimentin蛋白表达下调。免疫共沉淀实验显示,与NC+Control组比较,DM+Control组小鼠肾组织SnoN蛋白泛素化水平增加,而DM+BMP-7组小鼠肾组织SnoN蛋白泛素化水平较DM+Control组下降。结论:1.BMP-7通过激活经典的Smad1/5信号通路上调SnoN mRNA和蛋白水平,从而抑制高糖诱导的肾小管上皮细胞向间充质细胞转分化及细胞外基质的沉积。2.糖尿病小鼠予外源性BMP-7可以显著改善肾功能,活化肾组织Smad1/5蛋白,增加SnoN mRNA表达,降低泛素化水平而恢复其蛋白水平,从而减轻糖尿病肾病的纤维化病变。