【摘 要】
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目的 构建携带针对EBV潜伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER.retro.neo gfp RNAi逆转录病毒载体,并筛选出稳定产毒的细胞克隆,探讨LMP1特异性沉默对EBV阳性细胞凋亡的影响。 方法
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目的 构建携带针对EBV潜伏膜蛋白基因LMP1的pSUPER.retro.neo gfp RNAi逆转录病毒载体,并筛选出稳定产毒的细胞克隆,探讨LMP1特异性沉默对EBV阳性细胞凋亡的影响。 方法 采用DNA重组技术将60nt能转录产生靶向LMP1小发夹RNA(small hairpin RNA, shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER.retro.neo gfp,并用限制性内切酶酶切鉴定以及测序鉴定;脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317,G418筛选获得稳定产生逆转录病毒的细胞克隆;收集病毒上清,感染靶细胞Raji;采用RT-PCR检测靶基因LMP1的沉默效果,流式细胞术检测Raji细胞的凋亡。 结果 ①酶切鉴定及测序鉴定结果表明插入片段的序列和方向完全正确;② 重组载体转染包装细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆;③RT-PCR结果表明pSUPER.retro.neo gfp RNAi逆转录病毒可有效抑制Raji细胞中LMP1的表达,流式细胞仪检测表明LMP1沉默可导致Raji细胞凋亡,同时用细胞凋亡诱导剂TGF-β1处理时更为明显。 结论 成功构建了特异性沉默EBV潜伏期基因LMP1的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体,并筛选出稳定产毒的细胞克隆,初步实验结果表明逆转录病毒载体介导的RNA干涉能有效沉默靶基因LMP1的表达,并能诱导LMP1阳性细胞Raji的凋亡,为深入探讨LMP1基因特异性沉默对EBV阳性肿瘤的治疗作用奠定了实验基础。
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