觉醒睡眠是机体最为显著的生物节律。觉醒状态对我们至关重要,机体的感觉运动、学习记忆以及思维活动等均取决于良好觉醒状态的维持。长期以来丘脑被认为与觉醒维持高度相关。但丘脑解剖结构复杂,参与觉醒调控的特异丘脑核团以及其神经环路尚未阐明。近来本课题组其他成员发现,光遗传激活丘脑中的丘脑室旁核（Paraventricular thalamic nucleus,PVT）可快速诱导睡眠向觉醒转换。相反,化学遗传学抑制PVT神经元兴奋性或杀死PVT神经元,可促进非快速动眼睡眠（Non-rapid eye movement,NREM）睡眠的发生。较化学遗传学和特异的神经元杀死研究手段,电损毁技术可引起核团更为严重损毁,并能更好模拟临床上脑卒中引起核团综合性的损伤。为此,本研究采用了电损毁方法,探讨电损毁PVT对觉醒的影响。在此基础上,我们进一步探讨PVT功能活动的调控机制。回顾文献,我们发现外侧下丘脑（Lateral hypothalamus,LH）hypocretins促觉醒系统支配到PVT,并且PVT内谷氨酸神经元高表达hypocretins受体。与此同时,已有报道褪黑素分泌夜高昼低,在睡眠的发生起重要作用。PVT神经元高丰度地表达褪黑素受体。鉴于此,我们推测PVT不同的功能活动模式可能受控于hypocretins、褪黑素输入的调控。本研究采用多通道记录技术、膜片钳记录技术、光遗传以及形态学技术,探讨了PVT电损毁对觉醒睡眠行为影响,hypocretins、褪黑素对PVT神经元兴奋性的调控及其对觉醒睡眠行为的影响。主要结果如下:1.丘脑室旁核维持觉醒作用的进一步验证1.1 PVT损毁损害小鼠觉醒行为损毁仅限于PVT的51只动物中,我们发现有51%（n=26）的动物出现了昏迷;14%（n=7）的动物表现为昏睡;12%（n=6）动物表现为嗜睡;18%（n=9）动物表现为对外界刺激反应迟钝;另有18%（n=9）较假手术组动物无明显异常。在PVT重损毁动物中,昏迷发生百分比为55%,而在PVT轻损动物中,昏迷发生百分比仅为16%（Chi-square test,P<0.001,n=51）,该结果表明PVT电损毁的严重程度与觉醒损害程度成正相关。我们进一步开展了脑电肌电记录,定量观测PVT电损毁对觉醒睡眠的影响。PVT电损毁动物觉醒时间持续显著减少,黑暗期12 h平均觉醒时间由45±7%减少到21±3%（unpaired t test,P<0.01,n=13）。相反,NREM睡眠时间显著增加,黑暗期平均的NREM睡眠时间由51±6%增加到76±4%（unpaired t test,P<0.01,n=13）)。PVT电损毁并未影响到快速动眼睡眠（Rapid eye movement,REM）睡眠的时间（4.2±0.6%VS.3.1±1.0%,unpaired t test,P=0.46,n=13）。该结果表明PVT电损毁可持续引起黑暗期动物觉醒损害,增加睡眠时长。1.2 PVT损毁增加脑电低频的delta振荡活动在黑暗期12h连续监测脑电的动物中,觉醒状态下PVT电损毁可改变脑电的能量谱,损毁PVT可以引起低频段delta振荡能量增加（control:56±3%,n=5;lesion:64±3%,n=8,unpaired t test,P<0.05）。在睡眠状态下,PVT电损毁也引起了delta频段振荡能量增加（control;54±3%,n=5;lesion:67±3%,n=8,unpaired t test,P<0.01）。综上,该结果表明电毁损PVT不仅可以引起觉醒时间“量”的减少,也能引起觉醒“质”的损害。2.hypocretins神经元对PVT觉醒维持功能的调控及其机制2.1 PVT谷氨酸能神经元接受外侧下丘脑hypocretins神经元单突触输入为了鉴定PVT与LH的hypocretins神经元之间的神经环路联系,我们采用基于狂犬病毒（Rabies viruses,RV）的逆行单突触示踪技术。在PVT分别注射AAV helper和RV后,发现启动细胞局限性分布于PVT,提示可以选择性的标记PVT谷氨酸能神经元单突触输入。hypocretins免疫组化显示RV-dsRed标记的LH神经元与hypocretins共标,表明PVT谷氨酸能神经元接受hypocretins神经元的单突触输入。除RV-dsRed标记的hypocretins神经元之外,我们发现LH还分布有不与hypocretins共标的RV-dsRed神经元,表明PVT谷氨酸能神经元同时接受LH其他神经元的输入。2.2化学遗传学抑制LH_hypocretins→PVT通路降低觉醒为了研究hypocretins神经元的输入对PVT促觉醒功能的影响,我们使用化学遗传学方法特异性抑制LH_hypocretins→PVT通路。在小鼠活跃期开始（ZT 12）,通过埋置的导管向PVT局部微注射氧化氯氮平（Clozapine-N-oxide,CNO）（5 uM）。与生理盐水和mCherry对照组相比,CNO注射显著降低hM4D-mCherry小鼠觉醒量(two-way RM ANOVA,P _{hM4D（Saline vs CNO）}<0.001,P_{CNO（mCherry vs hM4D）}<0.001,n=5),并增加NREM睡眠量(two-way RM ANOVA,P _{hM4D（Saline vs CNO）}<0.001,P _{CNO（mCherry vs hM4D）}<0.001,n=5),而对REM睡眠无明显影响(two-way RM ANOVA,P _{virus vs compoind}=0.103,n=5)。进一步分析了化学遗传学抑制LH_hypocretins→PVT通路对最长觉醒片段时程的影响。与对照组相比,CNO微注射显著缩短最长觉醒片段时程（two-way RM ANOVA,P hM4D（Saline vs CNO）=0.01,P CNO（mCherry vs hM4D）<0.001,n=5）,提示抑制LHhypocretins→PVT通路觉醒维持能力下降。CNO注射抑制LH_hypocretins→PVT通路同时显著降低hM4D-mCherry小鼠进入NREM睡眠潜伏期(two-way RM ANOVA,P _{hM4D（Saline vs CNO）}=0.017,P _{CNO（mCherry vs hM4D）}=0.003,n=5)。但CNO注射对REM睡眠潜伏期无明显影响。CNO注射增加NREM睡眠片段的数量(two-way RM ANOVA,P _{hM4D（Saline vs CNO）}<0.001,P _{CNO（mCherry vs hM4D）}<0.001,n=5)。上述结果提示,化学遗传学抑制LH_hypocretins→PVT通路降低觉醒。2.3 PVT是hypocretins神经元促觉醒作用的重要下游靶点为了进一步验证LH_hypocretins→PVT通路在觉醒调控中的重要作用,我们使用化学遗传学方法激活hypocretins神经元的同时抑制PVT谷氨酸能神经元。在hypocretins-hM3D小鼠中,与溶剂组相比,CNO注射后觉醒量显著增加（two-way RM ANOVA,P=0.005,n=4）,NREM睡眠时间减少（two-way RM ANOVA,P=0.004,n=4）。与单独激活hypocretins神经元相比,hypocretins-hM3D+PVT-hM4D小鼠腹腔注射CNO以激活hypocretins神经元的同时抑制PVT谷氨酸能神经元,仍能引起觉醒时间增加,睡眠时间减少(two-way RM ANOVA,Wake:P _{hM3D vs hypocretins-hM3D+PVT-hM4D}=0.861;NREM:P _{hM3D vs hypocretins-hM3D+PVT-hM4D}=0.568,n=4)。该结果提示:CNO腹腔注射可激PVT内的hypocretins神经元末梢,引起hypocretins的释放,进而兴奋PVT。在此条件下,CNO可能并不能通过hM4D有效地抑制PVT谷氨酸能神经元的活动。为了深入探究LH_hypocretins→PVT通路在觉醒调控中的重要性,我们使用Caspase-3特异性毁损PVT谷氨酸能神经元并同时采用光遗传学方法激活hypocretins神经元。1 Hz、10 Hz和20 Hz光刺激诱发的对照组小鼠诱发NREM睡眠向觉醒转换。但是,在Caspase-3特异性毁损PVT谷氨酸能神经元的小鼠,PVT谷氨酸能神经元显著延长光刺激hypocretins神经元诱发的NREM睡眠向觉醒转换的潜伏期(unpaired t test,P_{1 Hz}=0.01,P_10Hz=0.02,P_{20 Hz}=0.03,n=5)。结果表明,毁损PVT谷氨酸能神经元降低hypocretins神经元的促觉醒效应,表明LH_hypocretins→PVT通路在觉醒调控中起重要作用。3.褪黑素对PVT觉醒维持功能的调控及其机制3.1褪黑素抑制PVT谷氨酸神经元兴奋性采用膜片钳记录,细胞外灌流褪黑素引起神经元产生超极化（1μM:2.6±0.8 mV,n=15;100μM:4.7±0.5 mV,n=6;500μM:7.2±1.6 mV,n=7;One Way Analysis of Variance on Ranks,P<0.01）,并显著抑制神经元的放电频率（1μM:65±8%,n=15;100μM:83±11%,n=6;500μM:98±2%,n=7;One Way Analysis of Variance on Ranks,P<0.01）。在MTR1/2阻断剂Luzindole存在的情况下,褪黑素并不能引起PVT神经元膜电位产生超极化（Luzindole:-42.84±1.98 mV;褪黑素+Luzindole:-42.75±2.04 mV,paired t test,P=0.86,n=5）。形态学检测在PVT有高丰度的MTR1表达,提示褪黑素主要通过作用于MTR1,进而抑制PVT谷氨酸神经元兴奋性。3.2褪黑素通过激活延迟激活钾通道产生膜电位的超极化神经元的兴奋性很大程度上取决于神经元内在特性的影响。在谷氨酸NMDA受体阻断剂、AMPA受体阻断剂以及GABA_A受体阻断剂存在下,褪黑素仍能引起PVT神经元产生超极化（褪黑素:4.7±1.5 mV;褪黑素+CNQX+AP5+PIC:3.6±0.6 mV,n=6,paired t test,P=0.23）。电压门控K⁺离子通道被认为参与神经元膜电位调控,与神经元兴奋性密切相关。采用了离子置换实验,将电极内液的K⁺用Cs⁺置换,灌流褪黑素并不能引起超极化。（基线:-50.3±1.8 mV;褪黑素:-46±2.2 mV,洗脱:-48.3±2.3 mV,n=6,One Way Repeated Measures ANOVA,P<0.01）。该结果表明褪黑素引起的抑制效应依赖于K⁺离子通道。瞬时激活K⁺通道和延迟激活K⁺通道是神经元主要的电压门控钾通道类型。褪黑素可显著增强延迟激活K⁺电流的幅度,而并未影响瞬时激活K⁺电流的幅度。综上,该结果表明褪黑素在PVT主要通过激活延迟激活K⁺通道进而产生抑制效应。3.3褪黑素抑制PVT兴奋性的突触传递神经元的兴奋性受到兴奋性与抑制性突触传递的影响。在GABA_A受体阻断剂存在的条件下,记录神经元自发兴奋性突触后电流（Spontaneous excitatory postsynaptic currents,SEPSCs）。褪黑素可逆地引起SEPSCs的频率减少（基线:1.9±0.2 Hz;褪黑素:1.5±0.2 Hz,n=14,RM ANOVA on Ranks,P<0.001）,并且可降低SEPSCs的幅度（基线:12.9±0.7 pA;褪黑素:11.9±0.7 pA,n=14,RM ANOVA on Ranks,P<0.001）,该结果表明褪黑素可降低PVT兴奋性的突触传递。在MRT1和MRT2受体阻断剂存在下,褪黑素对SEPSCs频率（基线:1.6±0.3 Hz;褪黑素:1.5±0.3 Hz,n=9,paired t test,P=0.53）和幅度（基线:10.5±0.5 pA;褪黑素:10.7±0.6 pA,n=9,paired t test,P=0.29）的抑制效应消失。基于形态学检测在PVT有高丰度的MTR1表达,褪黑素可能是通过激活MTR1,进而抑制兴奋性突触传递。在灌流液中加入谷氨酸NMDA受体阻断剂以及谷氨酸AMPA受体阻断剂,分离出自发抑制性突触后电流（Spontaneous inhibitory postsynaptic currents,SIPSCs）。褪黑素并不影响SIPSCs的频率（基线:1.9±0.3 Hz;褪黑素:1.9±0.4 Hz,n=8,One Way Repeated Measures ANOVA,P=0.90）,也未影响SIPSCs的幅度（基线:50.0±7.8 pA;褪黑素:49±8.5 pA,n=8,One Way Repeated Measures ANOVA,P=0.88）。对兴奋性突触传递的影响既可能是在突触前影响递质释放,也可能是作用于突触后谷氨酸的受体。在GABA_A受体阻断剂和河豚毒素（Tetrodotoxin,TTX）存在下,分离出微小兴奋性突触后电流（miniture excitatory postsynaptic currents,mEPSCs）。褪黑素对mEPSCs的频率并无明显效应（基线:1.5±0.4 Hz;褪黑素:1.3±0.3 Hz,n=8,One Way Repeated Measures ANOVA,P=0.24）,但可显著抑制mEPSCs的幅度（基线:12.8±0.6 pA;褪黑素:11.5±2.1 pA,n=8,One Way Repeated Measures ANOVA,P<0.01）。该结果表明褪黑素可在突触后影响谷氨酸受体的特性,进而抑制性兴奋性突触传递。3.4在体条件下褪黑素可抑制PVT神经元放电,并促进睡眠的发生采用了在体多通道结合神经药理学技术,观察了褪黑素对PVT神经元兴奋性的调控及其对睡眠觉醒行为的影响。褪黑素使得神经元放电频率由4.9±1.1 Hz下降到2.2±0.8 Hz（n=41,paired t test,P<0.001）。与此同时,PVT局部给予褪黑素可显著减少觉醒时间（溶剂:20.2±3.2 min,褪黑素:28.0±2.7 min;n=6,paired t test,P<0.01）,相反PVT内给予褪黑素可增加NREM睡眠（溶剂:48.5±4.9 min;褪黑素:55.3±5.5min,n=6,paired t test,P<0.01）和REM睡眠（溶剂:3.4±1.4 min;褪黑素:4.5±1.5min,n=6,paired t test,P<0.05）的时间。该结果表明褪黑素抑制PVT神经元的活动可促进觉醒向睡眠的转换。综上,电损毁PVT引起动物觉醒严重损害,主要表现为觉醒时间持续减少,脑电的能谱改变,觉醒相关低频的delta能量增加。外侧下丘脑hypocretins神经元可直接支配PVT神经元。其兴奋输入使PVT在觉醒期呈现高兴奋性状态,促进觉醒的维持。使用化学遗传学抑制hypocretins神经元-PVT谷氨酸神经元通路可引起觉醒时间减少,睡眠增加。同时,褪黑素通过增强胞体延迟整流钾电流,并抑制谷氨酸兴奋性突触输入,进而降低PVT神经元放电活动。在行为水平上,PVT内给予褪黑素可促进睡眠的发生。这种作用主要是通过激活MTR1介导。