论文部分内容阅读
1 SEA和喉癌MAGE-A3构建的真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA经过电穿孔转染在小鼠体内的转录 目的：检测真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA经过电穿孔转染在小鼠中的转录。 方法：将葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal endotoxin A，SEA）和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3（melanoma-associated antigen A3，MAGE-A3），构建成基因共表达的真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA。将pMAGEA3-IRES-SEA用电转染的方法免疫BALB/C小鼠单侧股四头肌，每两周一次，每次注射50μg，共免疫三次。末次免疫两周后，取注射部位组织，用荧光定量 PCR（qRT-PCR）法检测目的基因在注射部位肌肉中的转录情况。 结果：在实验小鼠注射部位的骨骼肌内检测到SEA、MAGE-A3基因转录mRNA。 结论：所构建的 pMAGEA3-IRES-SEA真核表达质粒，可通过电转染的方式，在小鼠体内能有效地转录。这为研究该质粒通过小鼠的体内转录蛋白的表达，诱导机体细胞免疫、体液免疫来清除喉癌，奠定了理论基础。 2喉癌来源黑色素瘤抗原的真核质粒在小鼠黑色素瘤细胞模型的表达 目的：测定 pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒在小鼠黑色素瘤 B16细胞的稳定表达，建立表达MAGE-A3肿瘤细胞模型。 方法：将喉癌来源的黑色素瘤抗原A3（melanoma-associated antigen A3，MAGE-A3）构建成真核质粒pIRES2-EGFP/MAGE-A3，脂质体法将pIRES2-EGFP/MAGE-A3转染小鼠黑色素瘤B16细胞，G418筛选阳性克隆，然后荧光显微镜检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）的表达，荧光定量PCR（qRT-PCR）检查MAGE-A3在B16细胞中的转录。 结果： pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒转染B16细胞后筛选得到阳性克隆，可见融合蛋白表达产生明亮的绿色荧光，qRT-PCR可检测到MAGE-A3 mRNA的转录。 结论： pIRES2-EGFP/MAGE-A3真核质粒通过脂质体法能有效转染，并在B16稳定表达，成功建立了MAGE-A3肿瘤细胞模型。 3葡萄球菌肠毒素A和黑色素瘤抗原A3构建的真核质粒在小鼠体内抗喉癌的效应 目的：观察真核质粒 pMAGEA3-IRES-SEA免疫小鼠后，鼠脾淋巴细胞对喉癌细胞模型B16/MAGE-A3的杀伤作用。 方法：先期将葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal endotoxin A，SEA）和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3（melanoma-associated antigen A3，MAGE-A3），构建成基因共表达的真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA，用电转染的方法免疫BALB/C小鼠单侧股四头肌。末次免疫两周后，取脾分离淋巴细胞，与B16/MAGE-A3细胞共同培养，MTT法观察活化的淋巴细胞对B16/MAGE-A3的杀伤情况。 结果： pMAGEA3-IRES-SEA真核质粒诱导小鼠细胞免疫明显高于对照组，杀伤率为57.72％。 结论：构建的pMAGEA3-IRES-SEA真核质粒可通过电转染的方式转录到小鼠体内，诱导细胞免疫，可杀伤B16/MAGE-A3细胞。为DNA疫苗接种途径、方法及抗喉癌疫苗的研究，提供了实验依据。