H9N2亚型禽流感病毒（avianinfluenzavirus,AIV）属于低致病性流感病毒,是目前我国养禽业中流行最广泛的禽流感病毒。H9N2亚型AIV可感染鸟类、哺乳动物及人等多种宿主。此外,H9N2亚型AIV还为H5、H7亚型高致病性AIV以及H10等亚型AIV提供内部基因,促进了潜在大流行风险的重组病毒的产生。自上个世纪九十年代末,我国养禽业开始大范围推广H9N2亚型AIV的灭活疫苗。然而,长期的疫苗选择压导致田间毒株发生了逃逸疫苗抗体的变异。以往的研究发现H9N2亚型AIV血凝素（hemagglutinin,HA）的变异是导致疫苗与田间毒株存在抗原性差异和免疫失败的主要原因。但是对于神经氨酸酶（neuraminidase,NA）的变异是否参与H9N2病毒的逃逸尚属未知。HA和NA是流感病毒囊膜上分布最多的两种糖蛋白。HA负责与细胞膜表面的唾液酸受体结合,而NA负责切割与受体的连接。HA和NA的功能性平衡在流感病毒复制、迁移和致病性方面起关键作用。靶向HA受体结合口袋和NA酶活性中心的中和抗体是最为关键的保护性抗体。但是流感病毒可以通过在抗体识别表位中或者相邻位点引入突变、缺失和糖基化修饰来逃逸这些中和抗体。为了鉴定H9N2病毒NA中逃逸保护性抗体的关键位点,我们制备了 22株抗A/Chicken/Jiangsu/XXM/1999（XXM）H9N2 病毒 NA 的单克隆抗体（monoclonal antibodies,mAbs）。利用1999年至2019年间分离的H9N2病毒与22株单克隆抗体反应,确定了抗体结合的相关位点,对NA抗体压下H9N2病毒HA和NA的关键变异位点进一步进行了研究和分析。1、抗H9N2病毒NA单克隆抗体的制备与特性分析在传统的H9N2禽流感病毒检测过程中发现其NA产生了氨基酸替换,但是利用序列比对和进化分析不能证明NA中确实存在抗原变异。为了对NA抗原表位及其变化进行全面分析,有必要制备大量针对H9N2禽流感病毒NA的单克隆抗体。本研究利用与经典H9N2灭活疫苗同源NA的XXM株H9N2病毒免疫小鼠。分离免疫小鼠的脾脏淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,一共筛选获得了 22株分泌针对XXM病毒NA单克隆抗体的杂交瘤细胞系,分别命名为A1C4、A1F1、A1G1、A2A3、A3C9、A3H3、A4C6、A5C9、A5D12、A6A7、A6D1、A6D6、A7E6、A7G7、A7G8、B1A11、B2B3、B2B6、B2G2、B4D6、B5B3和B6G5。所有的单克隆抗体的轻链都为Kappa链,重链均为IgG亚型。利用8周龄BALB/c小鼠制备了 22株单克隆抗体的腹水,并通过间接免疫荧光方法（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测了腹水效价。大部分单克隆抗体的IFA效价大于1:3000,但A7E6和B5B3的效价较低。22株单克隆抗体中有6株在体外中和实验中可以中和XXM株病毒。所有的单克隆抗体均不与H9N1（A/Chicken/Jiangsu/YZ/1999）病毒反应,其中有9株可以和犬源H3N2病毒（A/Canine/Jiangsu/06/2010）反应,此外有 8 株可以与野鸟源 H6N2（A/Eurasian teal/Jiangxi/49/2018）病毒反应。这些单克隆抗体为进一步研究H9N2病毒NA的抗原表位、抗原变异以及N2亚型流感病毒的跨种传播提供了材料。为了鉴定我国H9N2亚型AIV的NA抗原变异,我们利用19株自1999年到2019年田间分离的H9N2亚型AIV分离株与22株单克隆抗体进行IFA反应。19株H9N2病毒的NA序列在进化树中可以分为三个分支。第一分支的病毒具有与经典疫苗株类似的NA序列。第二分支的病毒主要以分离自2010年左右的病毒为主。第三分支的病毒由分离自2012年后的病毒组成,这些病毒也是当前养禽业中的流行毒株。IFA结果显示,22株单克隆抗体可以分为三组。第一组的单克隆抗体A1F1、A7E6、B2B3和B5B3只能与NA进化树上的第一分支的病毒反应。第二组的单克隆抗体A2A3、A4C6、A5D12和B4D6只能与第一、第二分支的病毒反应,但不能与第三分支的病毒反应。而第三组的单克隆抗体基本上可以与所有的病毒反应。2、NA抗体压下H9N2病毒NA的变异位点鉴定氨基酸序列比对结果显示,NA中的N356D突变是第一分支病毒与A/Chicken/Jiangsu/C1/2002 H9N2病毒及其他分支病毒的唯一差异。利用质粒定点突变方法,构建pCAGGS-NA（D356）突变质粒并转染COS-1细胞。IFA结果显示,只有B5B3单克隆抗体仍然可以正常识别NA突变体。其他第一组单克隆抗体不能或者仅能微弱结合突变的NA。以上结果证明,N356D突变是病毒逃逸第一组单克隆抗体的关键。第二组的单克隆抗体均具有中和活性,本研究通过逃逸株筛选的方法鉴定抗体与H9N2亚型AIVNA结合的关键残基。结果发现,病毒与第二组单克隆抗体孵育后筛选获得了在NA的344、368、369和400位的氨基酸突变。特别有趣的是,所有的第二组单克隆抗体均筛选到了在369位点的突变,说明这些单克隆抗体可能识别在369位点有重叠的表位。利用酶联免疫生物素实验（enzyme-linked lectin assay,ELLA）检测了第二组单克隆抗体对XXM H9N2 AIV及逃逸株的神经氨酸酶抑制（neuraminidase inhibition,NI）活性。NI结果显示,344位点的突变对降低A2A3单克隆抗体的抑制效果要强于其他单克隆抗体,而S400R突变使得A4C6和A5D12单克隆抗体几乎丧失对突变NA的抑制能力,但对A2A3和B4D6单克隆抗体影响不大。此外,NA中368和369位点的突变降低了所有第二组单克隆抗体的抑制效果,尤其是显著降低了 A4C6、A5D12和B4D6单克隆抗体的抑制效果。第三组的单克隆抗体A3C9和A6A7也具有中和活性。利用A3C9单克隆抗体筛选逃逸株,获得了 NA分别含有G125D/K296N、K296N和R253K突变的病毒,而A6A7单克隆抗体筛选NA仅具有单个G248E突变的逃逸株病毒。NI结果显示,除了 K296N以外的氨基酸变异均可以导致两株单克隆抗体的NI效果降低。尤其是R253K变异显著降低了 A3C9和A6A7单克隆抗体的抑制效果,说明A3C9和A6A7也在某种程度上结合重叠的表位。3、NA抗体压下H9N2病毒HA的变异位点鉴定HA蛋白和NA蛋白的功能性平衡是流感病毒的发生中起关键作用。但是对于NA特异性单克隆抗体是否对HA的生物学特性产生影响还有待探究。本研究在NA特异性单克隆抗体筛选的逃逸株HA中检测到了氨基酸突变并且与未突变HA的进行了生物学特性的比较。首先通过四甲基伞形酮乙酰神经氨酸（2’-（4-methylumbelliferyl）-a-D-N-acetylneuraminic acid,Mu-NANA）实验进一步检测了 6株具有中和能力的单克隆抗体的NI活性。在Mu-NANA中具有很高NI活性的A2A3和A3C9单克隆抗体在孵育病毒时可以诱导HA的166、198和234残基密码子发生更高比例的突变。在纯化的A2A3和A3C9单克隆抗体逃逸株中也鉴定出了相关位点的HA突变。受体结合实验证明,这些组合的或者单个的HA突变导致了受体偏好从α2,6唾液酸受体向α2,3唾液酸受体的转换。此外,这些突变还促进了病毒在MDCK细胞和小鼠肺脏中的复制。进一步研究发现,这些HA突变还降低了抗体对病毒的血凝抑制（hemagglutinin inhibition,HI）效价,说明HA的突变导致了 HA蛋白的抗原性变异。以上研究结果均表明,NA特异性单克隆抗体导致的HA突变影响病毒的受体偏好并且可能促进病毒逃逸体液免疫中的保护性抗体。进化分析结果也显示,H9N2亚型AIV中HA的相关位点的突变可能与NA抗体压有关。H9N2野毒株中的HA突变虽然未导致唾液酸受体的转换,但是可能是近年来人感染H9N2亚型AIV病例的增加的主要原因。本研究首先制备了 22株针对H9N2亚型AIVNA的单克隆抗体,并利用这些单克隆抗体对我国1999-2019年间的H9N2亚型AIVNA的抗原性变异进行了回顾性分析,证明H9N2病毒NA中确实存在规律性的抗原变异。本研究鉴定出了抗体结合的关键位点,结合序列分析发现NA中的D356、N368和G369是我国H9N2亚型AIV在NA抗体压下进化的关键标志。此外,我们发现NA抗体压导致的HA突变。这些HA突变使得H9N2亚型AIV由α2,6唾液酸受体偏好转换为α2,3唾液酸受体偏好,同时造成了 HA蛋白的抗原漂移,说明NA抗体压对于HA演化存在潜在的影响。