腹膜透析是终末期肾功能衰竭患者的主要肾脏替代疗法。腹膜纤维化是长期腹膜透析患者的主要并发症，最终会导致超滤功能的丧失以致退出腹膜透析。腹膜透析液的生物不相容性被认为是导致超滤失败和腹膜纤维化的主要原因。然而，目前为止，腹膜纤维化发生的具体机制仍不十分清楚，而且防治的措施也较为有限，因此探讨腹膜纤维化的发病机制，并寻求更为有效的治疗方法，将具有重要的临床意义。 血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)是RAS的重要组成成分。目前认为，局部产生的Ang Ⅱ作为一种重要的生长因子调节细胞的增殖，凋亡以及纤维化进程。血管紧张素Ⅱ可以引起细胞外基质的积聚以及细胞的转分化。同时，AngⅡ促进多种炎症因子的分泌，参与了AngⅡ引起的靶器官损伤过程。越来越多的证据表明，血管紧张素Ⅱ与腹膜纤维化的发生发展也密切相关，但其具体机制尚不十分明确。 近年来，活性氧(ROS)作为信号传递分子，在腹膜透析领域的作用正受到越来越多的关注。高糖腹膜透析液引起的氧化应激已被认为是导致腹膜结构和功能改变的主要因素之一。同时，血管紧张素Ⅱ也是引起氧化应激的最强刺激之一。因此我们推测，ROS可能参与了血管紧张素Ⅱ诱导的腹膜结构及功能的改变。NADPH氧化酶是ROS的主要调控酶，其胞浆成分p47phox，p67phox和胞膜成分p22phox，gp91phox是NADPH氧化酶发挥活性的关键亚基。关于此酶及其各个亚基的结构和功能目前国内外已有相当多的研究，但大都集中在心血管系统，而腹膜间皮细胞中该酶的具体功能国内外报道则很少，鉴于此，我们着眼于NADPH氧化酶在腹膜纤维化进展中的作用进行研究，从而为腹膜纤维化的防治开辟一条新途径。本研究应用Ang ⅡⅠ型受体(AT1)拮抗剂洛沙坦(Losartan)和NADPH氧化酶抑制剂DPI来观察对Ang Ⅱ诱导的大鼠腹膜间皮细胞(RPMCs)ROS产生以及NADPH氧化酶表达的影响，并进一步观察对下游效应包括炎症因子的表达，RPMCs转分化以及细胞外基质积聚三方面的作用，以探讨NADPH氧化酶依赖的ROS是否介导了Ang Ⅱ诱导的腹膜纤维化的发生发展及其可能机制。 一、研究目的 探讨NADPH氧化酶在Ang Ⅱ诱导的大鼠腹膜纤维化中的作用。 二、研究内容 1．观察大鼠腹膜间皮细胞中Ang Ⅱ诱导ROS产生和NADPH氧化酶的表达情况，以及Ang Ⅱ对炎症因子产生、转分化和细胞外基质积聚的影响。 2．探讨NADPH氧化酶在Ang Ⅱ诱导的大鼠腹膜纤维化中的作用。 3．探讨AT1受体是否介导了AngⅡ诱导的大鼠腹膜纤维化。 三、材料和方法1．细胞培养及分组采用胰酶消化法分离SD雄性大鼠原代腹膜间皮细胞，体外培养至第二代，并常规鉴定。将细胞静止24小时使其同步化后，加入AngⅡ(10<-7>M)孵育，部分实验组中应用AngⅡⅠ型受体拮抗剂Losartan(10<-5>M)或NADPH氧化酶活性抑制剂DPI(10<-5>M)提前孵育1小时进行干预处理。 2．检测方法 应用荧光染料(DCF)及激光共聚焦显微镜检测细胞内ROS的产生。RT-PCR检测NADPH氧化酶亚单位p47phox，p67phox，p22phox，gp91phox以及PAI-l、α-SMA、E-cadherin、MCP-1、IL-6 mRNA的表达。Western blot检测p47phox、α-SMA、PAI-1、COL-1的蛋白表达。 3．结果分析及统计学处理计算机密度分析采用单位面积计算机图像扫描值减去背景值的均值表示信号强度，以GAPDH作为内参照，计算两者吸光度的比值，并以对照组作为基准，计算其它各实验组相对吸光度值，以x±s表示。两组间比较采用独立样本凇验。P<0.05为差异有统计学意义。 四、结果 1．RPMCs的培养和鉴定培养的RPMCs呈多边形，菱形，椭圆形，大小不等。细胞融合后，呈典型的鹅卵石状或铺路石样上皮细胞形态。免疫组化结果示细胞角蛋白阳性。 2．AngⅡ对ROS产生及NADPH氧化酶各亚单位表达的影响以及DPI和Losartan的干预作用2.1 AngⅡI对ROS产生及NADPH氧化酶各亚单位表达的影响Ang Ⅱ刺激RPMCs后可显著增加细胞内ROS的产生，15 min时是对照组的3.64±0.53倍(P<0.05)。RT-PCR结果显示，Ang Ⅱ可诱导NADPH氧化酶亚单位p47phox，p22phox，gp91phox mRNA的表达上升，p67phox的表达虽有上升趋势，但与0 h相比差异无统计学意义。Western blot结果显示，AngⅡ可诱导p47phox蛋白表达上调，以48 h为高峰(P<0.05)。 2.2 DPI和Losartan对Ang Ⅱ诱导的ROS产生及NADPH氧化酶各亚单位表达的干预作用Ang Ⅱ刺激RPMCs 15 min后可显著增加细胞内ROS的产生，DPI和Losartan预处理可明显减少由AngⅡ诱导的ROS的产生增加，与AngⅡ组相比，使ROS分别下降了86.8﹪和77.4﹪(P<0.05)。RT-PCR结果显示，Losartan和DPI预处理可阻断由Ang Ⅱ诱导的p47phox和gp91phox mRNA表达的上调。但是DPI却显著刺激了p67phox的上调，其机制有待进一步研究。 3．Ang Ⅱ对炎症因子产生的影响以及DPI和Losartan的干预作用AngⅡ刺激RPMCs 8小时后可诱导MCP-1 mRNA的表达上调，Losartan和DPI预处理可阻断这种上调，使其分别降低了13.7﹪和53.6﹪(P<0.05)。AngⅡ显著增加了IL-6 mRNA的表达，是正常对照组的1.50±0.19倍，Losartan可抑制其表达上调，使其下降了33.4﹪(P<0.05)，但DPI却明显刺激了IL-6的表达上调，其机制有待进一步探讨。 4．Ang Ⅱ诱导RPMCs转分化以及DPI和Losartan的干预作用4.1 AngⅡ诱导RPMCs转分化AngⅡ诱导腹膜间皮细胞转分化标志α-SMA表达上调，其mRNA水平从2 h开始增加，4 h达高峰，为0 h组的1.84+0.19倍(P<0.05)，增高持续至12 h。Westernblot结果也显示，AngⅡ可明显增加α-SMA蛋白水平的表达，随时间逐渐增加，72 h达最高。AngⅡ可诱导E-Cadherin mRNA的表达下调，以12 h和24 h为著，24 h下降至0 h的59.3﹪(P<0.05)。 4.2 DPI和Losartan对AngⅡ诱导的RPMCs转分化的影响Losartan预处理后可以阻断由AngⅡ诱导的α-SMA表达上调，使α-SMAmRNA和蛋白水平降低，相比AngⅡ组分别下降了25.4﹪和50.0﹪(P<0.05)。DPI也可以阻断由AngⅡ诱导的α-SMA表达上调，与AngⅡ组相比，分别降低了其mRNA和蛋白水平的45.4﹪和56.1﹪(P<0.05)。RT-PCR结果显示，AngⅡ可诱导E-Cadherin mRNA的表达下调，Losartan和DPI可以明显逆转这种表达的下调，使其表达比AngⅡ组上升了63.8﹪和49.1﹪，差异有统计学意义(P<0.05)。 5．Ang Ⅱ对细胞外基质积聚的影响以及DPI和Losartan的干预作用5.1 Ang Ⅱ对细胞外基质积聚的影响RT-PCR结果显示，AngⅡ以时间依赖方式诱导PAI-1的mRNA表达上调，从2 h开始，持续至24 h，以8 h为高峰，为0 h组的3.50±0.56倍(P<0.05)。Western blot结果也显示，AngⅡ刺激RPMCs 24小时后可上调PAI-1及COL-1的蛋白表达水平，分别为对照组的1.64±0.25和1.28±0.09倍(P<0.05)。 5.2 DPI和Losartan对Ang Ⅱ诱导的细胞外基质积聚的干预作用AngⅡ诱导RPMCs PAI-1的mRNA和蛋白表达上调，Losartan和DPI可显著降低PAI-1的表达水平(P<0.05)。AngⅡ刺激RPMCs 24小时后可上调COL-1的蛋白表达水平，与刺激组相比，DPI可明显阻断这种上调，使其降低了71.9﹪(P<0.05)，而Losartan预处理则没有统计学差异。 五、结论 1．外源性Ang Ⅱ诱导大鼠腹膜间皮细胞ROS产生增加以及NADPH氧化酶p47phox，p22phox，gp91phox亚单位表达增加；并能够诱导大鼠腹膜间皮细胞炎症因子的产生、转分化及细胞外基质的积聚。 2．NADPH氧化酶介导了AngⅡ诱导的大鼠腹膜间皮细胞炎症因子MCP-1的表达、转分化及细胞外基质积聚过程。 3．ATl受体介导了AngⅡ诱导的大鼠腹膜间皮细胞炎症因子的产生、转分化以及PAI-1的表达。